适配子

摘要： 目的探索通过筛选获得的核酸适配子特异性结合5⁃羟色胺受体(5⁃HTR)从而阻断5⁃羟色胺(5⁃HT)摄取而达到拮抗抑郁的功效。方法小鼠5⁃HT1AR基因被克隆、构建、表达并纯化后作为靶标,利用指数富集的配体系统进化技术(SELEX)筛选能够特异性结合5⁃HT1AR的ssDNA(单链脱氧核苷酸)适配子,并测定ssDNA的结合位点、相对结合力及识别位点;并在体外细胞水平和小鼠抑郁模型中验证ssDNA适配子对5⁃HT摄取的影响及抗抑郁的疗效。结果成功克隆构建了pET28a⁃5⁃HT1A R质粒,质粒被转化入DH5ɑ细菌,IPTG诱导表达后通过6×组氨酸标签纯化5⁃HT1AR蛋白;经肽指纹图谱分析其与小鼠5⁃HT1A R蛋白一致;以此为靶标经过12轮的正向筛选和5轮的负向筛选,获得4个高亲和力和高特异性的适配子,且适配子能够识别相同位点。并在体外验证亲和力最高的18号适配子能够显著影响5⁃HT的摄取,且通过小鼠悬尾实验证明适配子静脉注射后对小鼠抑郁状态的改善。结论5⁃HTR适配子有望成为新型的抗抑郁药物,同时也为小分子拮抗剂的研究提供新思路。

摘要： 目的 利用指数富集的配体系统进化技术(SELEX)筛选与大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)特异性结合的核酸适配子,并对核酸适配子与大鼠BMSCs的结合方式及能力进行鉴定.方法 利用SELEX技术,以分离获取的大鼠BMSCs为靶点,从构建的核酸文库中最大程度富集与BMSCs特异性结合的核酸序列,流式细胞术检测文库富集的特异程度,荧光共聚焦实验观察文库与BM SCs的结合能力.对富集程度最高的文库进行克隆、序列测定及序列分析,获得候选适配子.使用RNA structure软件对候选适配子的二级结构进行预测,流式细胞术测定不同浓度候选适配子与BM-SCs结合后的平均荧光强度,使用SigmaPlot软件按公式Y=Bmax X/(X+Kd)获得每个候选适配子与BMSCs的结合曲线及平衡解离常数(Kd).挑选与BMSCs结合力最高的适配子,流式细胞术检测其与不同来源BMSCs的结合能力.结果 流式细胞术与荧光共聚焦实验表明SELEX筛选第9轮文库与BMSCs结合能力最高.经序列分析获得8个大鼠BMSCs特异性候选适配子,均能与BMSCs高亲和力结合,其中适配子apt7的亲和力最高,Kd值为(11.79±0.72)nmol/L.细胞选择性实验表明apt7仅与大鼠来源的BMSCs高亲和力结合,而不能结合小鼠及人来源的BMSCs.结论 通过SELEX技术成功筛选出能高亲和力、高特异性结合大鼠BMSCs的适配子apt7,此方法为BMSCs的鉴定提供了新思路和方法,同时为适配子应用于组织工程支架表面招募循环干细胞提供了实验依据.

摘要： 目的 探讨131Ⅰ标记肝癌核酸适配子JHIT2(131Ⅰ-JHIT2)作为肝癌靶向显像新型分子探针的可行性.方法 采用Ⅰodogen法制备131Ⅰ-JHIT2,纸层析法测标记率及放射化学纯度(放化纯度),检测其在不同溶液中不同时间的放化纯度.采用 γ 计数器分别测定131I-JHIT2与人肝癌细胞HepG2、正常肝细胞L02结合后细胞的放射性计数.HepG2荷瘤裸鼠尾静脉注射约0.74 MBq 131Ⅰ-JHIT2后不同时间处死,测定并计算各脏器每克组织放射性摄取值、肿瘤/肌肉(T/M)放射性比值.荷瘤裸鼠尾静脉注射约9.25 MBq 131Ⅰ-JHIT2后单光子发射计算机断层成像术(SPECT)-CT显像,观察并计算不同时间肿瘤/非肿瘤(T/NT)比值.两种细胞放射性计数比较采用t检验.结果 131Ⅰ-JHIT2标记率为(67.8±0.5)％,纯化后放化纯度为(91.4±1.1)％.室温下131Ⅰ-JHIT2在PBS、生理盐水24 h的放化纯度均>80％.131Ⅰ-JHIT2分别与两种细胞结合后,HepG2细胞的放射性计数为(415±9)CPM,明显高于L02细胞的(288±7)CPM(t=15.3,P<0.05).尾静脉注射131Ⅰ-JHIT2后,荷瘤鼠体内30 min、2 h肿瘤部位每克组织放射性摄取值分别为(4.17±2.83)、(2.22±0.64)％ID/g,T/M比值相应为2.01±1.15、2.07±0.82.SPECT-CT显像示,荷瘤裸鼠注射131Ⅰ-JHIT2后30 min,肿瘤部位可见放射性摄取,T/NT比值为2.63;2 h放射性减低,T/NT比值为1.82.结论 131Ⅰ-JHIT2探针在体外稳定性较好,对体外HepG2细胞及HepG2细胞荷瘤裸鼠模型具有一定靶向作用,为肝癌靶向核素诊疗奠定一定的基础.

摘要： 目的:验证适配子G81的纤维蛋白靶向性,评估适配子对凝血系统的影响.方法:以复钙法制备鼠源、人源体外纤维蛋白,将不同浓度Cy5.5标记的适配子溶液与之孵育,置于激光共聚焦显微镜下以固定的参数成像,用ImageJ软件进行相对荧光强度分析;将适配子G81溶液加入血浆中,通过倍比稀释法得到含浓度梯度适配子的血浆,采用SYSMEX CS-5100全自动血凝仪检测PT、APTT、TT,评估适配子G81对凝血功能的影响.结果:激光共聚焦显微镜显示适配子能与纤维蛋白结合,随着加入适配子量的增加其相对荧光强度逐渐增强,表明适配子可与纤维蛋白结合,统计分析提示荧光强度与适配子存在量效关系;人源、鼠源纤维蛋白结合的荧光强度无统计学差异(P＞0.05).在抗凝活性检测中,血浆中适配子G81浓度达到200 pmoL/mL时,各浓度统计分析结果均显示P＞0.05,表明适配子对PT、APTT、TT的测量均没有统计学差异上的影响.结论:适配子G81具有纤维蛋白靶向性,且当加入的适配子剂量低于200 pmol/mL时对内、外源性凝血功能、凝血酶时间均无明显影响.

摘要： 目的:研制一种适配子修饰的包裹纳米金棒和液态氟碳的PLGA纳米粒,以及观察其光致相变的效果.rn 方法:采用双乳化法制备包裹纳米金棒及液体氟碳的PLGA纳米粒.用碳二亚胺法将适配子与PLGA纳米粒连接得到"适配子-PLGA纳米粒"靶向相变造影剂.以激光仪辐照靶向相变纳米粒观察其光致相变情况.rn 结果:成功制备适配子修饰的包裹纳米金棒和液态氟碳的PLGA纳米粒,其平均粒径为628.3nm,激光辐照后,纳米粒光致相变效果明显.rn 结论:适配子与PLGA纳米粒成功连接,且该靶向相变纳米粒光致相变效果明显,从而使其能够成为良好的靶向超声/光声造影剂,为之后的体外/体内寻靶实验以及靶向超声/光声显像打下了良好的基础.

摘要： 适配子(aptamer)是通过SELEX体外筛选技术获得的具有识别能力的单链核酸分子.与抗体等传统的生物识别分子相比,适配子表现出更大的技术优势,因此,有关适配子的筛选和应用已成为近年来生物及化学领域的研究热点之一.在这里,我们报道一种基于适配子的荧光定量PCR分析方法的阶段性研究成果.该方法将适配子的识别特性和核酸分子碱基互补特性,和荧光定量PCR信号放大能力、精确定量能力结合在一起,其实验原理如图1所示.设计一条与适配子部分互补的模板分子,将这条模板分子与适配子液相杂交后固定于基质表面,由于适配子与靶分子的结合能力强于互补区的双链结合能力,当靶分子加入时,竞争结合的结果是靶分子与适配子结合,原与适配子结合的模板分子从固相基质上脱落下来,游离于液相中,吸取液相样品,荧光定量PCR操作即可分析靶分子.本文利用这种实验原理,选取了识别ATP的DNA适配子,对ATP进行了检测.

摘要： 以悍马法制备的GO为原料，利用水合肼还原的氧化石墨烯制备出化学还原的石墨烯(CR-GO)，然后将其滴涂在玻碳电极(GC)表面制备出CR-GO/GC复合电极，并通过与传统的玻碳电极和石墨改性的玻碳电极对比说明了CR-GO改性电极用于电化学传感器和生物传感器方面的巨大优势。

摘要： 适配子是经体外筛选(SELEX)的DNA或RNA单链寡核苷酸,具有类似于抗体对抗原的高亲和性和高特异性,其靶标物可以是药物分子、无机小离子、氨基酸、蛋白质甚至细胞.相对于抗体,适配子具有分子量小、结构简单、易合成修饰和可长期保存的优点,所以自90年代出现以后,越来越受到研究者的青睐。本文介绍了将高灵敏的光热分析法引入到适配子的研究中,在高盐环境下,对外显示TBA外侧磷酸负骨架,静电排斥,纳米金不能够聚集.α-凝血酶的加入,使TBA结构变为G-四链体,脱离纳米金,与α-凝血酶特异结合,纳米金聚集。检测α-凝血酶加入前后光热信号的变化从而实现对痕量α-凝血酶的识别和定量。

摘要： 本发明公开了一种IgE特异性核酸适配子，所述适配子具有如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列或为在由SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列基础上进行修饰所形成的核苷酸序列。本发明所述适配子可用于治疗变态反应性疾病，特别是用于治疗Ⅰ型变态反应。本发明所获得的适配子在保证了高亲和性的前提下，大大缩短了原A1适配子的核苷酸长度，所获得的适配子且特异性很高，可以更好的发挥生物学效应，利于提高后期适配子修饰的针对性，且由于核苷酸长度更短便于合成，节约成本，为后续该适配子药物研发奠定基础。

摘要： 本发明公开了特异性靶向胃癌细胞的适配子的筛选及筛选得到的适配子，属于生物分析和基因工程领域。本发明的筛选方法基于cell-SELEX技术，采用人胃癌细胞SGC7901细胞作为靶细胞，人胃黏膜细胞GES-1细胞作为反筛细胞；在反筛过程中不断增加反筛细胞的量、洗脱时间及洗脱液的体积；同时，逐渐缩短靶细胞的孵育时间，适当延长反筛细胞的孵育时间；通过数轮的筛选，得到与胃癌细胞特异性结合且结合力高的序列，即得到特异性靶向胃癌细胞的适配子。这些适配子的序列如SEQ ID NO.1-6所示，具有良好的结合力与特异性，能特异性的结合并靶向胃癌细胞，可用于胃癌的诊断及制备胃癌诊断药物。

摘要： 本发明涉及用于核酸适配子的筛选的多元微流体装置及利用其的核酸适配子的高通量筛选方法，特别是，将现有的对单一目标的适配子开发方式转换为改善的多元化平台的多元微流体装置及将其与高通量测序方法连接的核酸适配子的高通量筛选方法。本发明中的多元微流体装置不仅可以同时检测对多个目标的各个适配子，与现有的多元化技术相比，可以大幅缩减处理量及处理时间，特别是将本发明的装置与高通量测序方法连接而执行适配子筛选工序，从而可大幅减少目标结合/分离/放大工序过程，实现自动化工序，是非常有利的技术。

摘要： 本发明涉及生物领域，公开了一种用于适配子筛选的DNA双链分离方法以及适配子筛选方法和新的适配子；所述分离方法包括：1)取FITC-ssDNA亚文库溶液用酸进行中和；2)进行高分辨率琼脂糖电泳；3)分离ssDNA亚文库及其中的污染序列，切取ssDNA亚文库的目标条带，通过小分子量DNA纯化回收试剂盒进行回收，即得；所述适配子筛选方法还包括：1-1)准备随机ssDNA文库及引物；1-2)孵育筛选；1-3)扩增；1-4)取dsDNA与固定有链亲合素的磁珠进行孵育，然后加入碱性溶液即得；本发明新的适配子具有如SEQ ID NO.1或SEQNO.2所示的核苷酸序列。本发明提高了DNA双链分离效率，降低链亲合素及Biotin-ssDNA对ssDNA亚文库的污染，改善了筛选孵育过程中的细胞生存状态，提高cell-SELEX的成功率。

摘要： 本发明提供了一种硫代磷修饰适配子、硫代磷修饰适配子偶联T细胞及其制备方法与应用，所述硫代磷修饰适配子为将适配子5’端末端四个核苷酸间的3个磷酸二酯键进行硫代磷酸化修饰而获得。所述硫代磷修饰适配子偶联T细胞为将所述的硫代磷修饰适配子经DBCO修饰后与表面携带有叠氮基的激活T细胞偶联获得。该硫代磷修饰适配子亲和力高，稳定性高；该硫代磷修饰适配子偶联T细胞可以更好的识别靶细胞，能用于过继靶向治疗和杀伤肿瘤细胞。

摘要： 本发明公开了一种IgE特异性核酸适配子，所述适配子具有如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列或为在由SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列基础上进行修饰所形成的核苷酸序列。本发明所述适配子可用于治疗变态反应性疾病，特别是用于治疗Ⅰ型变态反应。本发明所获得的适配子在保证了高亲和性的前提下，大大缩短了原A1适配子的核苷酸长度，所获得的适配子且特异性很高，可以更好的发挥生物学效应，利于提高后期适配子修饰的针对性，且由于核苷酸长度更短便于合成，节约成本，为后续该适配子药物研发奠定基础。

摘要： 本发明公开了特异性靶向胃癌细胞的适配子的筛选及筛选得到的适配子，属于生物分析和基因工程领域。本发明的筛选方法基于cell-SELEX技术，采用人胃癌细胞SGC7901细胞作为靶细胞，人胃黏膜细胞GES-1细胞作为反筛细胞；在反筛过程中不断增加反筛细胞的量、洗脱时间及洗脱液的体积；同时，逐渐缩短靶细胞的孵育时间，适当延长反筛细胞的孵育时间；通过数轮的筛选，得到与胃癌细胞特异性结合且结合力高的序列，即得到特异性靶向胃癌细胞的适配子。这些适配子的序列如SEQIDNO.1-6所示，具有良好的结合力与特异性，能特异性的结合并靶向胃癌细胞，可用于胃癌的诊断及制备胃癌诊断药物。

摘要： 本发明涉及用于核酸适配子的筛选的多元微流体装置及利用其的核酸适配子的高通量筛选方法，特别是，将现有的对单一目标的适配子开发方式转换为改善的多元化平台的多元微流体装置及将其与高通量测序方法连接的核酸适配子的高通量筛选方法。本发明中的多元微流体装置不仅可以同时检测对多个目标的各个适配子，与现有的多元化技术相比，可以大幅缩减处理量及处理时间，特别是将本发明的装置与高通量测序方法连接而执行适配子筛选工序，从而可大幅减少目标结合/分离/放大工序过程，实现自动化工序，是非常有利的技术。

摘要： 本发明提供了一种特异性识别鸟‑胞内分枝杆菌复合群的DNA适配子及其筛选方法和应用。该DNA适配子的序列为SEQ ID NO.1。本发明在全细胞SELEX技术基础上利用构建进化发育树的方法系统地监测了整个筛选过程，进而获得了识别鸟‑胞内分枝杆菌复合群的DNA适配子MAC‑A11，其特异性高、亲和性好，可高特异性地识别鸟‑胞内分枝杆菌复合群，为MAC肺病的诊断和治疗提供了有力依据。

摘要： 本申请涉及多适配子靶标检测，描述了包含能够形成三元复合物的第一适配子、第二适配子和靶标的组合物及制备和使用此类组合物的方法，并且其中所述第一适配子和所述第二适配子包含不同的C‑5嘧啶修饰方案。