变构促红细胞生成素对中年雌性脑缺血小鼠白质损伤的作用研究

摘要

目的研究变构促红细胞生成素(MEPO)对成年雌性脑缺血小鼠白质的保护作用。方法将30只成年雌性C57BL/6J小鼠按随机数字表法完全随机分为3组:假手术组(Sham组),脑缺血模型组(Vehicle组)及脑缺血MEPO治疗组(MEPO组),每组10只。采用大脑中动脉远端血管永久性闭塞的方式制备小鼠脑缺血模型。MEPO组小鼠在大脑中动脉远端血管永久性闭塞即刻通过腹腔注射MEPO(5000 IU/kg),Vehicle组在制模后注入等量的等渗盐水,Sham组只进行血管暴露,不进行闭塞。脑缺血后第2天开始3组小鼠每天以50 mg/kg的剂量腹腔注射5-溴-2′-脱氧尿苷(BrdU),每日1次,持续至术后11 d。术前、术后每日记录各组小鼠的体质量。分别在术前及术后1、3、5、9、12、14 d采用贴条实验对小鼠神经功能进行评估[记录小鼠第1次触碰贴条所用的时间(接触时间)和将贴条撕掉所用的时间(移除时间)]。小鼠脑缺血后第3天,每组处死5只小鼠,2,3,5-三苯基氯化四氮唑(TTC)染色观察脑梗死和脑水肿程度(脑梗死百分比和脑水肿百分比)。脑缺血后第14天处死其余生存的小鼠,免疫荧光染色分别检测脑白质损伤程度[髓鞘碱性蛋白(MBP)/神经丝200(NF200)荧光强度比值]、小胶质细胞表型(采用Iba1标记小胶质细胞,CD16/Iba1标记M1型小胶质细胞,CD206/Iba1标记M2型小胶质细胞)、少突胶质细胞[2′,3′-环腺苷酸-3′-磷酸二酯酶(CNPase)标记成熟少突胶质细胞,BrdU标记新生细胞,两者共染阳性(CNPase+/BrdU+)表示新生的少突胶质细胞]以及CCAAT增强子结合蛋白β(C/EBPβ)在小胶质细胞中的表达情况(以C/EBPβ+/Iba1+表示)。结果(1)死亡:Vehicle组小鼠死亡2只(分别于术后12 d和13 d),MEPO组小鼠死亡1只(术后3 d),Sham组小鼠无死亡。(2)体质量:与Vehicle组比较,MEPO组小鼠体质量虽然有增加趋势,但差异均无统计学意义(均P>0.05)。(3)神经功能:与Vehicle组小鼠比较,MEPO组小鼠在脑缺血后第1、5、14天的移除时间均明显降低(均P<0.05)。(4)脑梗死和脑水肿体积百分比:脑缺血后3 d,MEPO组脑梗死百分比和脑水肿百分比分别为(22.7±5.9)%、(1.9±0.5)%,明显低于Vehicle组[分别为(37.0±9.8)%、(4.3±1.4)%],差异均有统计学意义(均P≤0.05)。(5)白质损伤:小鼠脑缺血后第14天,免疫荧光染色结果显示,Vehicle组和MEPO组小鼠均发生脱髓鞘,MEPO组脱髓鞘明显轻于Vehicle组;Sham组、Vehicle组、MEPO组小鼠的MBP/NF200荧光强度比值分别为4.6±0.8、0.9±0.5、2.9±1.0,差异有统计学意义(F=18.750,P<0.01);与Sham组比较,Vehicle组和MEPO组小鼠脑组织皮质区MBP/NF200荧光强度比值显著降低(均P<0.05);MEPO组小鼠脑组织皮质区MBP/NF200荧光强度比值明显高于Vehicle组(P<0.05)。(6)小胶质细胞表型变化:小鼠脑缺血后第14天,免疫荧光染色结果显示,Sham组的小胶质细胞处于相对静息状态,与Sham组比较,Vehicle组和MEPO组的M1和M2型小胶质细胞均发生活化。与Vehicle组比较,MEPO组小鼠脑组织中CD16+/Iba1+小胶质细胞数量有减少趋势,但差异无统计学意义[(154±47)个/mm^(2)比(237±47)个mm^(2),P=0.068];而MEPO组中CD206+/Iba1+小胶质细胞数量比Vehicle组明显增多[(218±49)个/mm^(2)比(121±43)个/mm^(2),P=0.042],小胶质细胞更倾向于M2表型极化。(7)少突胶质细胞新生:小鼠脑缺血后第14天,Sham组、Vehicle组、MEPO组CNPase+/BrdU+的细胞数量分比为(1.6±0.9)、(15.7±4.9)、(26.3±5.1)个/mm^(2),3组间差异有统计学意义(F=48.000,P<0.01);与Vehicle组比较,MEPO组中CNPase+/BrdU+细胞数量明显增加(P<0.05)。(8)小胶质细胞中C/EBPβ的表达:小鼠脑缺血后14 d,Sham组、Vehicle组、MEPO组C/EBPβ+/Iba1+细胞数量分别为(1.4±1.1)、(33.3±11.6)、(18.3±6.7)个/mm^(2),3组间差异有统计学意义(F=21.750,P<0.01);与Vehicle组比较,MEPO组中C/EBPβ+/Iba1+细胞数量明显减少(P<0.05)。结论MEPO对雌性小鼠脑缺血有神经保护作用,减轻了雌性小鼠脑缺血后的白质损伤程度,可能与降低小鼠脑缺血后的小胶质细胞中C/EBPβ的表达有关。