双链小片段干扰RNA抑制缺氧条件下乳鼠心肌细胞缺氧诱导因子1α表达

摘要

目的构建含缺氧诱导因子1α(HIF-1α)小片段干扰RNA(siRNA)靶序列的U6启动子表达框结构,观察其对缺氧条件下乳鼠心肌细胞HIF-1α表达的影响. 方法分离培养乳鼠心肌细胞,分为常规培养液对照组、RNA干扰(RNAi)组(转染无效干扰序列Ⅳ)、RNAi抑制组(转染有效干扰序列并按下游引物不同分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组).设计、合成3对(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ)含HIF-1α编码基因片段(正、反义)和1对(Ⅳ)随机序列(正、反义)的PCR下游引物.PCR法构建U6启动子表达框及相应正、反序列表达框,同时转染心肌细胞.每组每时相点5皿细胞.于缺氧1 h后,用蛋白免疫印迹法(Western-blot)测定其蛋白水平表达,免疫组织化学法检验干扰效果.缺氧6 h后采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法检测HIF-1α m RNA的表达. 结果筛选出的最佳抑制片段为Ⅱ组序列.缺氧1 h,对照组、RNAi组心肌细胞HIF-1α蛋白水平显著增高,Ⅰ、Ⅱ、ⅢRNAi抑制组HIF-1α蛋白水平较对照组明显降低,其中Ⅱ组降低最为显著(P<0.01);缺氧6 h,RNAi组心肌细胞HIF-1α mRNA水平较常氧条件下明显增高(P<0.01);RNAi抑制Ⅱ组未见明显增高(P>0.05). 结论构建的HIF-1αⅡ组表达框能有效地抑制缺氧乳鼠心肌细胞HIF-1α表达.