活性氧对烧伤大鼠血清诱导肺微血管内皮细胞凋亡的影响

摘要

目的观察大鼠严重烧伤后及肺微血管内皮细胞（PMVEC）经烧伤血清刺激后活性氧水平,探讨活性氧与PMVEC凋亡的关系。方法 （1）取24只SD大鼠按随机数字表法（分组方法下同）分为假伤组3只、烧伤组21只,烧伤组大鼠背部造成30%TBSAⅢ度烫伤,假伤组大鼠致假伤。伤后6、12、24、36、48、60、72 h按随机数字表法分别取3只烧伤组大鼠,腹主动脉取血,ELISA法检测血清中活性氧含量;假伤组大鼠行相同检测。（2）取5只SD大鼠按前述方法造成烫伤,伤后24 h制备烧伤大鼠血清;另取5只SD大鼠不作处理,制备健康大鼠血清。（3）切取20只SD大鼠幼鼠肺外边缘组织,组织块法培养细胞,免疫组织化学法鉴定细胞。取第3代对数生长期PMVEC分别接种于6孔板和12孔板,均分为4组（每组设3个复孔）:正常血清组、烧伤血清组,无血清内皮细胞专用培养液中分别加入体积分数15%健康大鼠血清、体积分数15%烧伤大鼠血清培养;正常血清+锰四（4-苯甲酸）卟啉（MnTBAP）组、烧伤血清+MnTBAP组,在前2组的基础上再分别加入100μmol/L MnTBAP培养。培养24 h后,流式细胞仪检测6孔板中细胞内活性氧含量,吖啶橙-溴化乙啶染色观察12孔板中细胞凋亡情况并计算凋亡率。对数据行单因素方差分析、LSD-t检验。结果 （1）烧伤组大鼠伤后24、36、48、60、72 h血清中活性氧含量分别为（1 87±21）、（235±22）、（231±25）、（291±20）、（315±23）nmol/mL,显著高于假伤组的（141±19）nmol/mL（t值分别为7.86、9.57、13.87、14.98、18.40,P值均小于0.01）。（2）原代培养细胞生长较慢,呈铺路石样生长;传代后细胞呈均匀分布生长。细胞凝血因子Ⅷ阳性表达率为（96±5）%,鉴定为PMVEC。（3）培养24 h后,正常血清组、烧伤血清组、正常血清+MnTBAP组、烧伤血清+MnTBAP组PMVEC中活性氧含量分别为798±40、1 294±84、763±59、926±42（F=93.01,P＜0.01）,细胞凋亡率分别为（6.2±1.3）%、（57.3±6.7）%、（3.7±0.8）%、（28.7±5.7）%（F=224.50,P＜0.01）。与正常血清组比较,烧伤血清组PMVEC中活性氧含量、细胞凋亡率明显增加（t值分别为10.40、49.06,P值均小于0.01）;烧伤血清+MnTBAP组PMVEC中活性氧含量、细胞凋亡率较烧伤血清组明显减少（t值分别为7.48、23.94,P值均小于0.01）。结论大鼠严重烧伤后血清中活性氧上升,烧伤大鼠血清刺激PMVEC可以导致细胞内活性氧以及细胞凋亡增加,应用MnTBAP清除活性氧可减少烧伤大鼠血清诱导的细胞凋亡。