转基因逆转椎间盘退变重组腺病毒载体Ad/CMV-hTGFβ1的构建

摘要

目的 构建一个高效的重组腺病毒载体Ad/CMV-hTGFβ1,用于进一步的基因转移逆转椎间盘退变的实验研究。方法 应用一种新的重组腺病毒构建系统来构建腺病毒载体。首先将hTGFβ1的cD-NA亚克隆到穿梭质粒pShuttle-CMV上。重组穿梭质粒pShuttle-CMV-hTGFβ经PmeI酶切线性化后,与超螺旋的病毒质粒pAdEasy-1共转染大肠杆菌BJ5183。两种质粒在BJ5183中进行同源重组,重组病毒质粒pAd/CMV-hTGFβ1经卡那霉素平板筛选获得。经酶切分析鉴定后,重组病毒质粒用PacI酶切线化。线化的病毒质粒经脂质体转染293细胞(包装细胞系),于2周内收集重组病毒。结果 重组腺病毒质粒经BamHI,PacI酶切鉴定,在0.8％的琼脂糖凝胶电泳中出现了诊断性片段;感染的293细胞出现了明显的细胞病变效应(CPE);PCR产物电泳证实了重组病毒的存在;免疫组织化学染色证实了hTGF-β1在293细胞中的表达。结论 重组腺病毒载体Ad/CMV-hTGFβ1的获得以及目的基因表达的验证使下一步的逆转椎间盘退变的实验研究成为可能。