悬浮培养HEK-293 N3S细胞生产重组腺病毒Ad-GFP的实验研究

摘要

利用5L生物反应器悬浮培养HEK-293 N3S细胞生产携带绿色荧光蛋白基因的重组腺病毒(recombinant adenovirusgreen fluorescent protein,Ad-GFP),为规模化生产腺病毒基因药物建立一种稳定可行的生产工艺.复苏的种子细胞进行逐级放大最后接入5L搅拌式生物反应器中,采用含5%胎牛血清(FBS)的DMEM/F12培基灌流培养293 N3S细胞,当细胞密度达到(2～4)× 106个/mL时感染Ad-GFP,48h后收获细胞,经两步氯化铯超速离心获得纯化的Ad-GFP.采用紫外分光光度计比色法和高压液相色谱法(HPLC)测定病毒颗粒数和纯度,采用组织培养半数感染剂量(TCID5o)法检测腺病毒的感染滴度.连续培养10～12d,细胞密度可达到(2～4)×106个/mL左右,纯化的Ad-GFP感染滴度和颗粒数分别为1.0×1011IU/mL和1.68×1012VP/mL,比活性为6.0%,A260/A280比值为1.33,产品纯度达到99.2%.建立了5L生物反应器悬浮培养293 N3S细胞生产重组腺病毒Ad-GFP的生产工艺,对携带其他基因的重组腺病毒药物生产具有一定的指导意义.