人成纤维细胞生长因子受体2IIIc及其突变型重组腺病毒的获得和在乳腺癌细胞中的表达

摘要

获得人成纤维细胞生长因子受体2IIIc(FGFR2IIIc)及其S252W突变型重组腺病毒,感染乳腺癌细胞MDA-MB-231,为下一步研究FGFR2IIIc基因的功能和作用机制奠定基础.以本实验室保存的含FGFR2IIIc基因的质粒为模板,PCR扩增得到FGFR2IIIc基因,重叠延伸法PCR获得FGFR2IIIcS252W突变型基因;分别将上述野生型和突变型基因克隆至腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV上,得到重组穿梭质粒pAdTrack-FGFR2IIIc和pAdTrack-FGFR2IIIcS252w,DNA测序证实.Pme I酶切后分别与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1共转化BJ-5183感受态细菌同源重组,得到的重组表达质粒Ad-FGFR2IIIc和Ad-FGFR2IIIcS252W Pac I酶切线性化后转染HEK293A细胞进行重组腺病毒的包装和扩增,通过GFP报告基因观察病毒表达情况.收集重组病毒颗粒并测定滴度,进一步感染乳腺癌细胞MDA-MB-231,RT-PCR和Western blotting方法检测目的基因的表达,3(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐(MTT)法和流式细胞术分析细胞增殖情况.结果表明,成功构建了人FGFR2IIIc及其S252W突变型基因的重组腺病毒表达载体,获得的重组腺病毒颗粒能高效感染MDA-MB-231细胞,并表达目的基因.MTT结果显示FGFR2IIIc和S252W均能抑制MDA-MB-231细胞增殖,S252W抑制效果更加明显.流式细胞术表明FGFR2IIIc和S252W均能使MDA-MB-231细胞周期停滞于G0/G1期,抑制细胞增殖.