灵杆菌非特异性核酸酶的原核表达、纯化及活性分析

摘要

以灵杆菌基因组DNA为模板,PCR扩增非特异性核酸酶(Non-specific nuclease,NU)基因,并克隆到pMAL-c4X载体上构建重组表达载体pMAL-c4X-NU.经测序及BLASTN发现其与灵杆菌Serratia marcescens核酸酶基因的同源性为97%.将构建的表达载体pMAL-c4X-NU转入大肠杆菌BL21,经IPTG诱导实现了胞内表达78 kDa的麦芽糖结合蛋白-NU融合蛋白(Maltose-binding protein-NU,MBP-NU),其最佳诱导表达条件为37℃,0.75 mmol/LIPTG诱导1.5 h.用Amylose resin纯化得到了目的蛋白.活性检测表明MBP-NU具有同时降解DNA和RNA的活性,在37℃、pH 8.0时活性最高,比活力为1.11×106 U/mg,目标蛋白的纯化效率可达10.875 mg/L.纯化的目标蛋白中无蛋白酶活性存在.0.5 mmol/L乙二胺四乙酸(Ethylene diamine tetraacetic acid,EDTA)、l mmol/L苯甲基磺酰氟(Phenylmethanesulfonyl fluoride,PMSF)以及150 mmol/L KCl对MBP-NU的活性几乎无影响,因此MBP-NU可作为蛋白质纯化过程中核酸的高效降解酶.