APRT缺陷型CHO细胞系的建立及其重组蛋白表达能力评价

摘要

中国仓鼠卵巢（Chinese hamster ovary, CHO）细胞是生产复杂重组药物蛋白的首选宿主细胞，腺嘌呤磷酸核糖转移酶（adenine phosphoribosyltransferase, APRT）催化腺嘌呤与磷酸核糖缩合形成腺苷一磷酸，是嘌呤生物合成步骤中的关键酶。采用基因编辑技术敲除CHO细胞中aprt基因，验证获得的APRT缺陷型CHO细胞系的生物学特性；构建两种真核表达载体：对照载体(含有目的基因增强型绿色荧光蛋白（enhanced green fluorescent protein,EGFP）和弱化载体（含有启动子和起始密码子突变的aprt弱化表达盒及EGFP），分别转染APRT缺陷型和野生型CHO细胞并筛选获得稳定转染的细胞池；重组CHO细胞传代培养60代并用流式细胞术检测EGFP表达的平均荧光强度，并比较不同实验组重组蛋白EGFP的表达稳定性。PCR扩增和测序结果表明，CHO细胞aprt基因成功敲除；获得的APRT缺陷型CHO细胞系在细胞形态、生长增殖、倍增时间等生物学特性方面与野生CHO细胞无显著差异。目的蛋白瞬时表达结果表明，与野生型CHO细胞相比，转染对照载体和弱化载体的APRT缺陷型CHO细胞系中EGFP的表达分别提高了42%±6%和56%±9%；特别是长期传代培养时，转染弱化载体的APRT缺陷型细胞中EGFP表达量显著高于野生型CHO细胞（P＜0.05）；构建的基于APRT缺陷型CHO细胞系能够明显提高重组蛋白的长期表达稳定性。研究结果为建立高效稳定的CHO细胞表达系统提供了一种有效的细胞工程策略。