腺相关病毒介导胰岛素样生长因子Ⅰ对高糖诱导神经元凋亡的保护作用

摘要

目的 研究重组腺相关病毒(AAV)载体介导胰岛素样生长因子Ⅰ(IGF Ⅰ)在体外神经元表达的情况,及其对高糖诱导神经元凋亡的保护作用.方法 利用分子克隆技术将大鼠IGF Ⅰ基因克隆到pSNAV2.0质粒上,构建包含重组质粒pSNAV2.0-IGF Ⅰ的杂合型重组AAV载体rAAV2/1-IGF Ⅰ.将人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞分为正常组(A组)、无血清组(B组)、无血清高糖组(C组),无血清高糖+rAAV2/1-IGF Ⅰ组(D组),其中A组不做任何处理;B组使用无血清培养基培养;C组用含100mmol/L D-葡萄糖的无血清培养基培养;D组则先用rAAV2/1-IGF Ⅰ病毒载体感染后再用含100 mmol/LD-葡萄糖的无血清培养基处理.干预24 h后应用RT-PCR和Western免疫印迹检测各组IGF Ⅰ基因和蛋白的表达情况;应用Hoechst33342荧光染色法、AnnexinV-FITC/PI双染法流式细胞仪检测细胞凋亡.观察rAAV2/1-IGF Ⅰ感染后对高糖诱导SH-SY5Y细胞凋亡的保护作用.结果 成功构建rAAV2/1-IGF Ⅰ重组AAV载体.感染SH-SY5Y细胞后,RT-PCR显示SH-SY5Y能表达大鼠IGF Ⅰ基因;Western免疫印迹检测发现D组IGF Ⅰ蛋白的表达水平(0.44±0.04)显著高于其他3组(A组0.29±0.02,B组0.17+0.02,C组0.08±0.02,均P<0.05).rAAV2/1-IGF Ⅰ能明显降低高糖诱导细胞捌亡的凋亡率:Hoechst33342荧光染色检测总凋亡率分别为A组(2.71±1.03)%,B组(9.17±1.72)%,C组(25.63±1.81)%,D组(14.50±2.27)%,各组间差异均有统计学意义(P<0.05);流式细胞仪分析结果表明AnnexinV-FITC~+/PI~+的早期凋亡细胞加上AnnexinV-FITC~+/PI~+的晚期凋亡细胞的总细胞凋亡率A组为(5.01±1.17)%,B组为(9.87±1.38)%,C组为(27.56±2.25)%,D组为(17.34±2.08)%,各组间差异均有统计学意义(P<0.05).结论 rAAV2/1-IGF Ⅰ感染体外神经元SH-SY5Y细胞能显著表达IGF Ⅰ蛋白,并有效地降低高糖对神经元的诱导凋亡作用.