重组6型腺相关病毒介导的绿色荧光蛋白在野百合碱诱导肺动脉高压大鼠肺组织中的表达

摘要

目的 探讨重组6型腺相关病毒(rAAV6)介导的绿色荧光蛋白ZsGreen在野百合碱诱导的动脉型肺动脉高压(PAH)大鼠中的转染效果及表达,为进一步利用此病毒载体进行PAH机制研究提供实验依据.方法 将24只雄性Sprague-Dawley (SD)大鼠随机分为正常对照组、PAH模型组和PAH病毒组,每组8只.PAH模型组和PAH病毒组大鼠颈背部皮下单次注射野百合碱60 mg/kg建立PAH模型,造模后1d PAH病毒组大鼠气管内注射100μl含1×1011vg rAAV6-ZsGreen液,PAH模型组大鼠气管内注射等体积PBS,正常对照组大鼠颈背部皮下注射等体积生理盐水,且气管内注射等体积PBS.造模3周后各组大鼠称重,采用右心导管法检测右室收缩压(RVSP)和平均肺动脉压(mPAP).取大鼠新鲜肺组织制备冰冻切片,采用苏木精-伊红染色检查大鼠肺组织病理学改变并计算肺动脉中膜厚度(WT)百分比,采用免疫荧光法观察大鼠肺组织中ZsGreen荧光强度变化.收集游离心脏标本测定右心室肥厚指数(RVHI).采用Western blot法检测各组大鼠肺组织中ZsGreen蛋白的表达.结果 PAH模型鼠体重明显低于正常对照组,造模大鼠RVSP、mPAP、RVHI和WT百分比均明显高于正常对照组大鼠,提示野百合碱诱导PAH大鼠造模成功.荧光显微镜下可见PAH病毒组大鼠肺组织中ZsGreen平均荧光强度(A值)为33.471±5.147,明显高于正常对照组的4.581±1.871和PAH模型组的4.167±1.249,差异均有统计学意义(均P＜0.05),并在肺组织中呈广泛分布,包括肺血管内中膜.Western blot检测显示,正常对照组、PAH模型组和PAH病毒组大鼠肺组织中ZsGreen蛋白相对表达量(灰度值)分别为0.072±0.017、0.067±0.019和0.317±0.062,PAH病毒组大鼠组肺组织ZsGreen蛋白相对表达量明显高于正常对照组和PAH模型组,差异有统计学意义(均P＜0.05).苏木精-伊红染色显示,PAH病毒组大鼠肺组织炎性细胞浸润及肺组织结构紊乱并未比PAH模型组大鼠明显增加.结论 rAAV6可介导ZsGreen转染野百合碱诱导的PAH大鼠,提示rAAV6-ZsGreen可能成为PAH基因治疗的有效载体.