光遗传技术通过Wnt/β-Catenin通路对新生神经元的影响

摘要

目的:探讨Wnt/β-catenin信号通路光遗传技术在促进新生神经元成熟中的作用.方法:从胎鼠大脑皮层中提取神经干细胞,用携带DCX-ChR2-EGFP基因的慢病毒感染神经干细胞,观察神经干细胞分化为新生神经元后DCX的表达.实验细胞分为3组(n=9):对照组、NSCs+EGFP和NSCs+ChR2组.其中对照组为正常培养的NSCs(NSCs组);NSCs+EGFP组为携带DCX-EGFP基因慢病毒感染神经干细胞组;NSCs+ChR2组为携带DCX-ChR2-EGFP基因慢病毒感染神经干细胞组.病毒感染后48 h后连续3 d行470 nm蓝激光照射,然后检测各组Ne-uN+阳性细胞(成熟神经元标志物)的密度和NeuN+/Hoechst比值情况;Western blot检测各组成熟神经元相关蛋白MAP2、NeuN、Neurog2、NeuroD1和GluR2蛋白表达水平和Wnt/β-catenin通道相关蛋白TCF4和 β-catenin蛋白的表达水平.用L-型钙通道阻断剂100μmol/L维拉帕米或50μg/ml的 β-catenin抑制剂Dkk1处理NSCs+ChR2组细胞,然后行Western blot检测各组MAP2、NeuN、Neurog2、NeuroD1和GluR2蛋白表达水平.结果:连续3 d 470 nm蓝激光照射后,NSCs+ChR2组中NeuN+阳性细胞密度(成熟细胞)和NeuN+/Hoechst明显高于NSCs组和NSCs+EG-FP组(P均<0.05);Western blot检测的MAP2、NeuN、Neurog2、NeuroD1、GluR2蛋白及Wnt/β-catenin通路相关蛋白β-catenin、TCF4表达水平均明显高于NSCs组和NSCs+EGFP组(P均<0.01);L-型钙通道阻断剂维拉帕米或 β-catenin抑制剂Dkk1处理NSCs+ChR2组细胞后MAP2、Neurog2、NeuroD1和GluR2蛋白表达水平明显下降(P均<0.01),NeuN表达水平也下降(P<0.05).证明ChR2通道蛋白开放产生阳离子内流促进新生神经元成熟,是通过Wnt/β-catenin信号通路实现的.结论:光遗传学方法通过Wnt/β-catenin信号通路促进新生神经元成熟.