结核性与恶性胸腔积液中微小核糖核酸内参基因筛选的初步研究

摘要

目的 探讨应用实时荧光定量PCR检测胸腔积液中微小核糖核酸(miRNA)表达量的适宜内参基因.方法 搜集2016年9月至2018年12月在首都医科大学附属北京胸科医院确诊治疗的47例结核性胸膜炎患者和31例并发胸腔积液的癌症患者作为研究对象.采用实时荧光定量PCR(SYBR Green引物法)和熔解曲线法分析所有患者胸腔积液标本中纳入研究的U6、Cel-miR-39、rniR-16、miR-20a、miR-192、miR-1268、miR-4281共7个miRNA内参基因的表达量[循环阈值(Ct值)]和引物扩增效率,其中Ct值越低,表示基因表达量越高,越适合用于相对定量检测;引物扩增效率介于90％?110％之间,则可以用于后续胸腔积液中miRNA的检测,而平滑且单峰的熔解曲线则表示扩增产物的特异度良好.通过geNorm软件(M值)、NormFinder软件(稳定值)和BestKeeper软件(标准差和变异系数)来分析各内参基因的稳定性,其中M＜1.5、稳定值及标准差和变异系数数值越小,内参基因越稳定.同时,分析标本检测的重复性,以及标本不同处理方法对miRNA检测结果的影响.结果 78份标本中,检测miR-1268、Cel-miR-39、miR-16的Ct值较低,分别为19.16±4.40、24.17±0.73、24.52±1.65;扩增效率分别为90％、101％、110％,可以用于后续胸腔积液miRNA检测;且7种内参基因的熔解曲线均平滑且单峰,特异度均较好.geNorm、NormFinder和BestKeeper软件分析Cel-miR-39的M值、稳定值、标准差和变异系数均为最低(分别为0.994、0.674、0.73和3.02％).7个内参基因在标本重复检测中的稳定性均较好,且在标本采集后1 h、2 h、4 h及反复冻融2次后的miRNA表达量与采样后立即处理的表达量未见差异.结论 Cel-miR-39稳定性好,表达丰度适中,适宜作为实时荧光定量PCR技术定量检测胸腔积液中miRNA表达量的内参基因.