基于恒温隔绝式荧光RT-PCR技术现场检测牛纽布病毒方法的建立及应用

摘要

纽布病毒(nebovirus,NeV)是引起犊牛腹泻的新发病原,本试验旨在建立基于恒温隔绝式RT-PCR(insulated isothermal RT-PCR,iiRT-PCR)技术现场检测NeV的方法。根据NeV的RdRp基因的保守区域,设计并合成引物和探针,优化检测体系和检测试剂预混方法,建立检测NeV的iiRT-PCR方法。结果显示,成功建立了检测NeV的iiRT-PCR方法,该方法只特异性检出NeV,对牛冠状病毒、牛诺如病毒、A群牛轮状病毒、牛病毒性腹泻病毒、牛凸隆病毒、牛大肠杆菌、牛沙门菌、牛瑞氏隐孢子虫和牛艾美尔球虫等无关病原不检出,批间变异系数为3.07%~3.12%,批内变异系数为2.45%~3.01%,检测下限为5.38 copies·μL^(-1)。应用此方法对2020—2021年采集自红原县、若尔盖县、凉山彝族自治州西昌市和阆中市的101份犊牛腹泻样本进行检测,NeV的检出率为64.36%。本研究成功建立了检测NeV的iiRT-PCR方法,具有特异性强、稳定性好和灵敏度高的特点,检测试剂预混后配合使用PetNAD核酸萃取试剂盒,可实现NeV的现场检测,从核酸提取到报告检测结果仅需1 h,操作方便,为NeV的快速诊断提供了有力的工具。