GnIH过表达载体构建及其对小鼠睾丸间质细胞的作用研究

摘要

本试验通过构建GnIH过表达载体,探究其对小鼠睾丸间质细胞(TM3细胞系)的凋亡效应及睾酮合成的调节作用.从6～8周雄性小鼠睾丸组织中提取RNA,反转录获得cDNA样本,利用PCR扩增并纯化GnIH基因,应用T4连接酶将其连入PLVX-IRES-ZsGreen1载体,进一步转化到感受态菌中,通过PCR、双酶切及测序鉴定后提取质粒.随后将构建好的重组质粒转染TM3细胞系72 h,分为空质粒组和GnIH过表达组,通过显微镜观察细胞荧光、实时荧光定量PCR(qRT-PCR)法、ELISA法和流式细胞术检测GnIH表达水平、细胞凋亡率及相关凋亡基因表达变化、睾酮分泌水平和睾酮合成酶基因表达水平.结果显示,GnIH扩增片段序列与参考序列一致,将GnIH过表达质粒转染至TM3细胞系72 h后,可见高强度绿色荧光,过表达组中GnIH基因水平极显著升高(P＜0.01),表明GnIH过表达载体构建成功且在TM3细胞系中高表达.转染72 h后,与空质粒组相比,过表达组中细胞凋亡率极显著升高(P＜0.01),凋亡基因P53和Bax/Bcl-2表达量比值也极显著升高(P＜0.01).与空质粒组相比,过表达组中睾酮浓度极显著降低(P＜0.01).与此同时,睾酮合成相关酶基因P450 sccmRNA表达量极显著降低(P＜0.01),StAR、3β-HSD和P450c17 mRNA表达量显著降低(P＜0.05),17 β-HSD mRNA表达量在两组间无显著性差异(P＞0.05).综上所述,在体外培养的TM3细胞中过表达GniIH能诱导TM3细胞凋亡、抑制睾酮分泌且降低睾酮合成相关酶的基因表达水平,推断GnIH在小鼠睾丸间质细胞生长和睾酮合成过程中发挥负调控作用.本研究可为揭示GnIH在雄性哺乳动物生殖调控过程中的作用提供科学理论依据.