兔原始生殖细胞体外培养的研究

摘要

旨在探索兔原始生殖细胞(primordial germ cells,PGCs)体外分离培养的最佳条件,从而建立成熟稳定的兔PGCs体外分离培养方法.本研究首先通过两种不同的体外分离法(胰酶消化法、机械法)和3种不同的传代法(胰酶消化法、机械法、连同饲养层消化法)探索第14～18天胎兔的PGCs体外分离传代的最佳方式,另将培养液分为A、B、C、D4组,以D组为对照组,探究不同细胞因子浓度对兔PGCs形态变化及集落形成的影响.其次,利用碱性磷酸酶染色(alkaline phosphatase staining,AKP)法对兔PGCs进行鉴定染色;实时荧光定量(real-time polymerase chain reaction,RT-PCR)检测转录因子Oct-4的表达.结果 表明,机械法分离得到的兔PGCs集落数量是酶消化法分离的2.2倍,而兔PGCs经不同的消化法传代发现,酶消化法、连同饲养层消化法、机械法在兔胚胎成纤维细胞(rabbit embryo fibroblast,REF)饲养层上分别成功传至P2、P2、P4代.B组PGCs培养液(基础液+10％胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)+2 ng· mL-1转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)+4 ng·mL-1碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)+ 10 ng·mL-1白血病抑制因子(leukemia inhibitory factor,LIF))所获得的集落数量最多,具有较好的集落形态,保持未分化的时间较长.AKP染色结果显示,PGCs集落呈红黑色;RT-PCR结果显示,体外分离培养的兔PGCs表达转录因子Oct-4.结果 显示,兔原代PGCs最适采用机械分离法和机械传代法进行体外分离传代,适宜浓度的细胞因子添加至兔PGCs培养液中有利于兔PGCs在体外保持较多的集落数量和较长时间的未分化状态.本研究通过筛选和优化兔PGCs体外培养方法,为进一步建立稳定成熟兔PGCs细胞系奠定技术基础.