原始生殖细胞

摘要： 目的:构建小鼠原始生殖细胞(PGCs)报告基因系统。方法:根据CRISPR基因编辑技术结合同源重组原理,针对鼠Prdm1和Dppa3基因的翻译起始位点ATG附近位置分别设计一对sgRNA,并根据Cas9切割位点以及拟插入目的片段构建相应的用于同源重组的供体质粒,将sgRNA与Donor质粒同时转染入小鼠胚胎干细胞(ESCs)中,并利用质粒携带的抗性基因筛选出目标单克隆细胞,并进行基因型鉴定。结果:通过提取单克隆细胞的基因组DNA进行基因型鉴定,PCR和Sanger测序结果显示,单克隆细胞的基因组中,Prdm1和Dppa3基因翻译起始位点后分别成功插入eGFP和mCherry荧光蛋白编码序列。利用细胞因子诱导eGFP-Prdm1/mCherry-Dppa3mESCs(mouse ESCs)定向分化为mPGCs(mouse PGCs),流式细胞仪检测显示诱导分化的mPGCs特异表达eGFP和mCherry荧光信号。结论:成功构建mPGCs报告基因系统,可用于后续研究mPGCs命运决定的分子机制,对于研究小鼠早期胚胎发育过程具有重要意义。

摘要： 为获得鸡原始生殖细胞(primordial germ cells,PGCs)的最佳转染效率,本研究比较不同质粒用量和不同细胞数在3种转染试剂(Lipofectamine 2000、3000和LTX&Plus Reagent)中PGCs的转染效率,利用荧光激活细胞分选技术(fluorescence activated cell sorting technology,FACS)辅助优化Lipofectamine 3000转染试剂,经FACS进一步分选获得带绿色荧光蛋白(GFP)的PGCs,继续培养3周后,移植回注到受体鸡胚中,移植3.5 d后分离性腺拍照观察.结果显示,转染试剂Lipofectamine 3000的转染效率最高,质粒、Lipofectamine 3000转染试剂和PGCs细胞数的配比为3μg:4μL:0.5×104个,转染5 h转染效率最高,达到23.4％,与现有的研究结果相比提高了2倍以上.移植回注PGCs到受体鸡胚中,荧光显微镜观察到鸡胚性腺中有GFP阳性细胞.本研究综合考虑转染试剂、质粒用量和细胞数量的影响因素以优化PGCs的转染条件,为高效制备转基因鸡及基因编辑鸡的研究奠定基础.

摘要： 本研究采用石蜡组织切片和H.E.染色法对军曹鱼原始性腺的形成、分化及精巢和卵巢首周年发育的组织结构变化进行观察.结果 显示,军曹鱼原始生殖细胞在7孵化日龄(days post hatching,dph)时迁移到达生殖嵴,随后体细胞出现聚集和分裂,并于15 dph将原始生殖细胞完全包绕形成原始性腺.军曹鱼卵巢分化的时间要早于精巢,34 dph的稚鱼性腺组织尚未分化,但可观察到两种存在明显组织学差异的性腺类型,其中一种类型的性腺出现卵原细胞群,而另一种类型的性腺横切面较狭长,生殖细胞数量明显较少,因此推定为未分化精巢;卵巢的解剖学分化开始于44 dph,其标志为卵巢腔的形成;50 dph时精巢开始细胞学上的分化,此时精原细胞由基底膜包被形成囊泡状的细胞团.在首周年发育期间(60～360 dph),军曹鱼的精巢发育包含Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ5个时期,而卵巢发育只包含Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ3个时期.60 dph时,精巢和卵巢均处于Ⅰ期;90 dph时,精巢发育至Ⅱ期,卵巢仍处于Ⅰ期;120 dph时,超过半数的精巢已发育至Ⅲ期,仅少部分卵巢发育至Ⅱ期;150 dph时,精巢已发育至Ⅲ期,而大部分卵巢发育至Ⅱ期;185 dph时,精巢仍为Ⅲ期,卵巢均已发育至Ⅱ期;210 dph时,大部分精巢发育至Ⅳ期,卵巢仍处于Ⅱ期;360 dph时,精巢已发育至Ⅴ期,大部分卵巢发育至Ⅲ期.上述研究结果可丰富军曹鱼的繁殖生物学研究基础,阐明其早期性腺发育规律,还可为其人工繁殖提供理论依据.

摘要： cqvip:精子和卵子结合而成的受精卵是一个新生命的开始。受精卵不断分裂、分化,在经过胚胎发育、器官形成等过程后长成新个体。其中部分细胞成为原始生殖细胞,它们是新个体产生精子或卵子的源泉,这里所发生的一切将决定新个体后代的命运。

摘要： 世界范围内不孕症发病率呈逐年增加趋势,虽然ART可以帮助大部分不孕女性获得成功分娩,但仍无法解决少部分因缺乏健康配子导致的不孕女性的生育难题。小鼠干细胞体外诱导分化为生殖细胞体系的建立,为探索人类干细胞的诱导分化积累了初步经验,尤其是小鼠干细胞来源的配子成功受精、妊娠以及健康子代小鼠的出生,给科研人员带来了极大的鼓舞。虽然,人类干细胞体外诱导为生殖细胞的研究尚未取得成功,但随着干细胞再生与转化技术的进步,人类干细胞诱导为功能性生殖细胞的愿望必将实现,进而为众多因缺乏健康配子导致不孕的夫妇带来更多的希望和福音。

摘要： 旨在探索兔原始生殖细胞(primordial germ cells,PGCs)体外分离培养的最佳条件,从而建立成熟稳定的兔PGCs体外分离培养方法.本研究首先通过两种不同的体外分离法(胰酶消化法、机械法)和3种不同的传代法(胰酶消化法、机械法、连同饲养层消化法)探索第14～18天胎兔的PGCs体外分离传代的最佳方式,另将培养液分为A、B、C、D4组,以D组为对照组,探究不同细胞因子浓度对兔PGCs形态变化及集落形成的影响.其次,利用碱性磷酸酶染色(alkaline phosphatase staining,AKP)法对兔PGCs进行鉴定染色;实时荧光定量(real-time polymerase chain reaction,RT-PCR)检测转录因子Oct-4的表达.结果 表明,机械法分离得到的兔PGCs集落数量是酶消化法分离的2.2倍,而兔PGCs经不同的消化法传代发现,酶消化法、连同饲养层消化法、机械法在兔胚胎成纤维细胞(rabbit embryo fibroblast,REF)饲养层上分别成功传至P2、P2、P4代.B组PGCs培养液(基础液+10％胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)+2 ng· mL-1转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)+4 ng·mL-1碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)+ 10 ng·mL-1白血病抑制因子(leukemia inhibitory factor,LIF))所获得的集落数量最多,具有较好的集落形态,保持未分化的时间较长.AKP染色结果显示,PGCs集落呈红黑色;RT-PCR结果显示,体外分离培养的兔PGCs表达转录因子Oct-4.结果 显示,兔原代PGCs最适采用机械分离法和机械传代法进行体外分离传代,适宜浓度的细胞因子添加至兔PGCs培养液中有利于兔PGCs在体外保持较多的集落数量和较长时间的未分化状态.本研究通过筛选和优化兔PGCs体外培养方法,为进一步建立稳定成熟兔PGCs细胞系奠定技术基础.

摘要： 越来越多的证据表明,除经典的遗传控制外,表观遗传调控也参与到众多的细胞发育过程.雌性果蝇幼虫性腺的发育涉及细胞增殖及分化,是良好细胞生物学在体研究模型.文章通过果蝇遗传学实验方法,研究发现ATP依赖的染色质重塑因子Brahma(Brm)参与调控雌性果蝇幼虫原始生殖细胞(PGC)有序分化的证据,brm基因突变的三龄幼虫雌性果蝇,PGC的分化被提前开启;此外,特异性的将PGC中的brm表达量下调,也发现PGC的提前分化.这说明,表观遗传调控因子Brm参与调控雌性果蝇幼虫性腺发育,并以细胞自治性的方式调控原始生殖细胞的有序分化.

摘要： 鱼类原始生殖细胞(primordial germ cells,PGCs)为配子的前体,在发育生物学和水产养殖领域具有极其重要意义.在基础科学研究中,PGCs提供了研究细胞迁移机制的理想模型;在保护濒危物种的应用科学中,PGCs是低温保存的最佳细胞类型,可保存亲代基因组信息.随着对青鳉Oryzias latipes和斑马鱼Danio rerio等模式生物的研究,使用PGCs标记基因研究生殖细胞的迁移和发育备受关注.这些标记基因可以鉴定PGCs及其分布、增殖和迁移,为研究鱼类的性腺分化机制奠定了基础,为确定人工性别控制诱导敏感期和单性群体育种提供科学依据.本文介绍了Dead end、Vasa和Nanos系列鱼类PGCs标记基因的特点及研究现状,可为鱼类种质资源保存及性控育种等提供参考.

摘要： 性腺发育对鱼类的成功繁殖与种群延续至关重要.鱼类的性腺发育包括原始性腺的形成和分化、性腺的组织结构、形态特征与时相划分以及环境因素对性腺发育的影响等.掌握鱼类原始生殖细胞(Primordial germcells,PGCs)的起源、迁移和分化特征是研究性腺发育规律的基础.鱼类的PGCs出现于胚胎发育早期,以不同方式迁移到生殖嵴,与生殖上皮共同形成原始性腺,之后向精巢或卵巢分化.鱼类性别决定和性分化呈多元性,既有雌雄同体也有雌雄异体.遗传和环境因素(如温度、光照、激素和pH等)影响性腺的性别分化,具有可逆可塑性.判断鱼类性腺分化方向依据两方面:一是观察性腺的组织学形态特征变化;二是以性原细胞的出现及其减数分裂的细胞学分化.性腺分化主要包括雌雄异体、雌雄同体和性逆转三种类型;雌雄异体型又分为分化型和未分化型.本文通过综述鱼类原始生殖细胞的起源、迁移和分化、性别分化以及性腺发育的研究进展,以期为鱼类性腺发育的研究提供参考.

摘要： 原始生殖细胞(Primordial germ cells,PGCs)是生殖细胞的前体细胞,作为一种生殖干细胞,其具有与胚胎干细胞相似的形态及分化潜能,能进行体外培养及传代,并能在一定前提下保持其未分化状态及全能性.目前对于禽类胚胎干细胞(embryonic stem cells,ESCs)、胚胎生殖细胞(embryonic germ cells,EGCs)等细胞系的建立还很少,较好的维持PGCs的体外存活和促进其快速增殖,是研究者们现面临的首要问题.本文将对禽PGCs的起源与迁移、体外培养体系以及主要细胞因子对其体外培养作用进行简单的阐述.

摘要： 目的：探讨一种简单有效的培养小鼠原始生殖细胞(primordial germ cells,PGCs)的方法,以期为研究小鼠模型的PGCs提供充足的材料来源.方法：体外分离出Oct4ΔPE∶GFP转基因小鼠胚胎13.5天的生殖嵴,剪碎后,用含有血清、白血病抑制因子、胰岛素-转铁蛋白-硒添加剂和重组表皮生长因子等的α-MEM培养基进行组织贴壁法培养.结果：经培养后的PGCs的可以获得快速增殖和传代的能力,并且可以通过碱性磷酸酶(AP)和自身Oct4激发荧光鉴定均成阳性表达.结论：利用该培养方案能培养出高纯度且具有良好干性的小鼠PGCs.

摘要： 原始生殖细胞(Primordial germ cells,PGCs)是生殖母细胞的前体细胞,作为一种多能干细胞,具有与胚胎干细胞相似的形态及分化潜能,能在体外进行培养、传代,并在一定条件下保持未分化状态及多能性.现阶段PGCs的体外培养体系中往往存在饲养层细胞和血清,为后期研究造成了困难和混淆.为建立粤黄鸡原始生殖细胞(PGCs)的体外无饲养层培养体系,给体外研究禽类PGCs增殖调控机制打下良好的基础,本研究通过改进培养体系成分分离纯化PGCs并进行体外培养.结果显示,所得无饲养层培养的PGCs直径为6～8μm,生长曲线呈现"S"形,群体倍增时间(3.75±0.15)d,表明PGCs具有良好的增殖生长状态;对分离纯化的PGCs特异性基因胚胎阶段特异性表面抗原(stage specifi embryonic antigen-1,SSEA-1)和类无精症缺失基因(deleted in azoospermia-like,DAZL)进行免疫荧光鉴定,结果显示二者在PGCs均有表达,经化学免疫染色的细胞可观察到绿色的荧光;将无饲养层培养的PGCs用PKH26标记,注射到孵化至17HH-20HH受体鸡胚的背主动脉中,继续孵化至第5.5d,结果显示,分离纯化并通过PKH26标记的鸡胚血液PGCs仍然具有PGCs的特性,可随鸡胚的血液循环定殖于鸡胚性腺中.本研究优化了PGCs体外培养的条件,建立无饲养层无血清培养体系,为家禽PGCs应用于现代保种技术、转基因技术以及家禽的发育生物学等研究领域,提供了重要的技术支持.

摘要： 邻苯二甲酸二丁酯(Dibutyl phthalate,DBP)属于环境内分泌干扰物(Environmental Endocrine disrupters,EEDs),以μg/L甚至mg/L的浓度污染各种水生环境并长期稳定存在.研究表明出生前DBP暴露引起其子代精巢发育异常,间质(Leydig)细胞增生,抑制睾酮产生和显现类似睾丸发育不全综合症(testicular dysgenesis syndrome,TDS)效应.斑马鱼(zebrafish,Danio rerio)是高效而普适的新型毒性评价模型.本研究在基于成年斑马鱼DBP暴露0.2,0.6和1.8mg/L连续30天生殖毒性模型基础上,探索FO代DBP暴露对F1代测交胚胎发育敏感期的致畸胎作用和精巢原始生殖细胞(primordial germ cells,PGCs)迁移、分化的影响以及F1代测交成年斑马鱼跨代精巢组织病理学特征,以补充DBP对斑马鱼跨代遗传数据的短缺.

摘要： 在适宜的体外培养条件下,动物的原始生殖细胞(PGCs)可以被重编程为胚胎生殖细胞(EGCs).同胚胎干细胞一样,EGCs具有自我更新能力和多向分化潜能.除了小鼠以外，目前尚缺乏对其它哺乳动物PGCs的系统性研究，尤其是PGCs体内、外重新获得多能性的过程。这在某种程度上限制了人们对于其它物种配子发生的认知和其真正意义上的EGCs的获得。在最近的研究中，观察了22-30天胎龄的巴马迷你猪生殖峭的组织形态，发现其性腺分化几乎同步于生殖嵴PGCs的Blimp 1核表达的降低过程，研究了猪PGCs重编程所涉及的分子事件，结果发现bFGF不仅在猪PGCs去分化的最初通过抑制Blimp 1核表达发挥作用，还能抑制培养细胞凋亡。研究结果拓展了对于家畜配子发生和PGCs重编程机制的认知。

摘要： 建立鹌鹑原始生殖细胞系，并对其进行鉴定。本试验对5.5天鹌鹑胚胎PGCs的分离、纯化、培养进行了研究，分别在无饲养层和生长因子的培养液中、鸡成纤维饲养层、添加LIF＼SCF＼bFGF的鸡成纤维饲养层上对鹌鹑P-GCs进行培养。鹌鹑PGCs在添加生长因子的鸡成纤维饲养层上存活10天以上，经传代后仍能存活及分裂。建立了鹌鹑原始生殖细胞系，为禽类胚胎干细胞的进一步研究奠定了基础。

摘要： 根据家禽PGCs的迁移路径,分别从孵化24h的鸡胚生殖新月(gcPGC)、2.5d的胚血(cPGC)和5.5d的生殖腺(gPGC)中分离PGCs,置于完全培养液中培养,表达干细胞标志物SSEA-1和生殖细胞特异标志物DAZL,表明成功分离得到PGCs.CCK-8法细胞增殖检测显示,BRL-3A饲养层细胞能明显促进PGCs的体外增殖,与无饲养层条件培养的PGCs间有显著差异,但不同来源PGCs间无增殖速度的差异.检测这3种不同来源PGCs的克隆形成能力,结果显示cPGCs的克隆形成率最高,克隆体积最大.RealTime-PCR结果显示多能性相关基因cNanog和cPouV在gcPGCs中的表达量最高,而生殖相关基因Dazl和Cvh在cPGCs中的表达量最高.结果表明,体外培养的PGC保持其体内遗传状况,即gcPGC的多能性最好,cPGC开始进入生殖系分化,而gPGC可能已部分进入减数分裂.而从培养特性上来看,gcPGC由于数量过少难以扩大培养,而gPGC混合的分化细胞过多,cPGC是体外培养和增殖分化研究的最佳细胞来源.

摘要： 原始生殖细胞(PGCs)是最早形成的一类具有分化形成卵母细胞和精母细胞潜力的细胞,研究其发生、迁移与分化对揭露鱼类性别的分化机制具有重要理论意义,而且在鱼类育性控制育种方面具有重要的应用价值.斑马鱼原始生殖细胞的形成由早期卵母细胞生殖质决定.本研究分别利用TALENs技术和转基因技术获得了斑马鱼zfsd1基因的敲除家系(zfsd1-KO)和zfsd1基因的过表达家系(zfsd1-OE).rn 研究发现，对照家系(control)雌雄比例为4:6，但zfsd1-KO家系后代雌性与雄性比例为1:9，而zfsd1-OE家系后代雌性与雄性比例为9.5:0.5。结果提示zfsdl基因在斑马鱼性别分化中具有重要作用。

摘要： 微小核糖核酸(microRNA)是一类长度约为22个核苷酸、进化上高度保守的非编码单链RNA分子，它们参与生物的发育、分化、凋亡等一系列生命过程。最近的研究发现，microRNA在原始生殖细胞的发育、精子发生以及受精过程中都发挥着重要作用。本文对微小核糖核酸与生殖关系进行了探讨，指出虽然目前的研究显示精子内的miRNA在受精卵中的作用并不明显，一些组织特异性的miRNA还尚未被发现，但从原始生殖细胞到成熟精子的整个发展过程，miRNA都起着十分重要的作用。Ostermeier等已证明了人类精子以及辜丸组织含有范围广泛的miRNA,因此对其深入的研究具有极大的理论和临床价值。

摘要： 本发明属于家禽养殖与生殖管理技术领域，具体涉及血管内皮细胞生长因子在促进鸡原始生殖细胞增殖和迁移中的应用。比较了血管内皮细胞生长因子(VEGF)对鸡原始生殖细胞增殖和迁移能力的影响。在现有鸡原始生殖细胞培养液基础上添加适宜浓度的VEGF，可促进鸡原始生殖细胞的增殖，加入VEGF浓度不同，对鸡原始生殖细胞增殖促进作用不相同，当血管内VEGF浓度为25ng/mL和处理3天时应用效果最佳。本发明能有效地促进鸡原始生殖细胞在体外的增殖，基础培养液中适宜浓度VEGF对鸡原始生殖细胞可显著提高迁移定植到性腺的能力，生物学特性维持不变。

摘要： 本发明涉及一种人皮肤干细胞体外向原始生殖细胞分化的技术方法，利用机械法分离人皮肤干细胞，体外培养人皮肤干细胞，利用人皮肤干细胞体外形成拟胚体的方法进行分化，分化后用骨形态发生蛋白-4、干细胞生长因子、表皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子等细胞因子体外诱导14天，可获得一些能够表达早期生殖细胞基因的原始生殖细胞样细胞；之后采用猪的卵泡液进行诱导。本发明方法获得了与体内正常原始生殖细胞形态和特异分子标记表达原始生殖细胞样细胞，细胞荧光分析体外诱导得到的原始生殖细胞样细胞表达Stra8和Dazl，能够达到早期减数分裂。

摘要： 本发明涉及一种小鼠毛囊干细胞体外向原始生殖细胞分化的技术方法，按照如下步骤操作：第一步，利用机械法分离出生后7天小鼠触须部毛囊；第二步，体外培养毛囊干细胞：毛囊经DMEM/F-12洗完后，置于0.25% Trypsin-0.04%EDTA，37°C消化10分钟，轻轻吹打混匀后加入10%血清终止消化，于DMEM/F-12中清洗，过400目细胞筛后转入毛囊干细胞培养液培养；第三步，将传代两次的毛囊干细胞体外培养形成拟胚体EB；第四步，制作小鼠成纤维细胞培养及饲养层细胞；第五步，EB培养后与饲养层共培养向原始生殖细胞分化。本发明方法获得了与体内正常原始生殖细胞形态和特异分子标记表达类似的原始生殖细胞。

摘要： 一种在体外将原始生殖细胞分化为原始卵泡的方法，所述方法为将原始生殖细胞以及邻接于所述原始生殖细胞的支持细胞在加压条件下或低氧气浓度下培养的方法。

摘要： 一种鸡成纤维细胞转分化为原始生殖细胞介导生产转基因鸡的方法，属于生物技术领域。通过OCT4,SOX2,NANOG,LIN28A诱导鸡CEF重编程为iPS；通过BMP4/BMP8b/EGF诱导鸡iPS分化为iPGC；鸡iPGC血管注射介导转基因鸡生产。本发明的实验方法不仅在家禽上种质资源保护过程中可行，在脊椎动物的其他研究领域也可应用。这一发明将为体外诱导的PGC‑like细胞介导后代鸡的生产研究提供更多的理论基础和技术支撑，也有利于对禽类种质资源进行保护和利用，同时也有利于转基因鸡的生产研究。

摘要： 本发明属于家禽养殖与生殖管理技术领域，具体涉及血管内皮细胞生长因子在促进鸡原始生殖细胞增殖和迁移中的应用。比较了血管内皮细胞生长因子(VEGF)对鸡原始生殖细胞增殖和迁移能力的影响。在现有鸡原始生殖细胞培养液基础上添加适宜浓度的VEGF，可促进鸡原始生殖细胞的增殖，加入VEGF浓度不同，对鸡原始生殖细胞增殖促进作用不相同，当血管内VEGF浓度为25ng/mL和处理3天时应用效果最佳。本发明能有效地促进鸡原始生殖细胞在体外的增殖，基础培养液中适宜浓度VEGF对鸡原始生殖细胞可显著提高迁移定植到性腺的能力，生物学特性维持不变。

摘要： 本发明涉及细胞诱导分化领域，尤其涉及诱导分化培养基以及多能干细胞诱导分化为原始生殖细胞的方法。一种诱导分化培养基，为含有卵泡液和多种细胞因子的分化培养基；其中，分化培养基是在细胞培养的基础培养基中添加血清替代物、谷氨酰胺、非必需氨基酸和β‑巯基乙醇而得，以基础培养基计，各组分含量如下：血清替代物体积百分数为5％±0.5％，谷氨酰胺2±0.2mM，非必需氨基酸0.1±0.01mM，β‑巯基乙醇0.1±0.01mM。本发明提供的诱导分化培养基，通过添加卵泡液，提供了将iPSCs分化为女性生殖细胞的自然分化微环境；在人卵泡液及多种细胞因子联合作用下，iPSCs经过诱导获得晚期PGCLCs，不经过拟胚体形成阶段，周期短，并且避免了细胞量少的问题。

摘要： 本发明提供一种寻找胚胎干细胞向原始生殖细胞分化过程中Wnt信号通路的靶基因的方法，涉及生物技术领域，本发明所述方法首先对Wnt信号通路的关键转录因子TCF7L2进行靶基因预测，对预测靶基因进行GO功能注释，筛选出其中共同参与生殖细胞发育及干细胞分化的保守性靶基因作为待选靶基因；通过体内外试验验证Wnt信号对待选靶基因转录水平的调控作用，检测待选靶基因的启动子中所述转录因子结合位点缺失时、Wnt信号对待选靶基因转录水平是否有调节作用，通过ChIP‑qPCR验证β‑Catenin/转录因子复合物与待选靶基因的结合作用，从而确定待选靶基因是否对Wnt信号具有靶向响应作用。本发明所述方法简单易行。

摘要： 本发明的课题是提供一种通过体外培养将原始生殖细胞分化为功能GV期卵母细胞的方法。本发明涉及一种通过体外培养将原始生殖细胞分化为功能GV期卵母细胞的方法，其包括：(a)通过在消除雌激素或具有与雌激素相似的功能的因子的影响的条件下，培养原始生殖细胞和邻近原始生殖细胞的支持细胞来产生次级卵泡的步骤；(b)部分地切割颗粒细胞层和膜细胞层之间的结合的步骤，其中卵母细胞、颗粒细胞层和膜细胞层构成产生的次级卵泡；和(c)通过在含有高分子化合物的培养基中培养构成次级卵泡的卵母细胞、颗粒细胞层和膜细胞层，使卵母细胞分化为功能GV期卵母细胞的步骤。

摘要： 本发明是一种促进小鼠皮肤来源干细胞分化的原始生殖细胞增殖的方法，包括以下操作步骤：第一步，小鼠皮肤干细胞的分离培养；第二步，小鼠皮肤干细胞体外形成拟胚体结构；第三步，小鼠胚胎成纤维细胞的培养及饲养层细胞的制备；第四步，拟胚体细胞与饲养层细胞共培养向原始生殖细胞分化；其中，在第四步中加入视黄酸来促进原始生殖细胞的增殖。视黄酸能够促进皮肤干细胞来源的原始生殖细胞以及体内来源的原始生殖细胞的体外增殖，达到了从有限的材料来源获得大量的原始细胞样细胞的目的，操作简便，可重复性好。