在体外将原始生殖细胞分化为原始卵泡的方法

摘要

一种在体外将原始生殖细胞分化为原始卵泡的方法，所述方法为将原始生殖细胞以及邻接于所述原始生殖细胞的支持细胞在加压条件下或低氧气浓度下培养的方法。

说明书

技术领域

本发明涉及一种在体外将原始生殖细胞分化为原始卵泡的方法。本申请主张基于2018年6月21日在日本申请的特愿2018-117988号的优先权，在此引用其内容。

背景技术

生物体内存在构成身体的体细胞以及将遗传讯息传递至下一世代的生殖细胞。尤其，雌性生殖细胞的卵子是在完成早期发育中扮演重要角色的细胞。哺乳类中的雌性生殖细胞的经历为，在胚胎期时原始生殖细胞增殖，而后进入减数分裂，大部分的细胞几乎在出生同时死亡。残存的卵母细胞同时形成原始卵泡以及周围的颗粒细胞。此种雌性生殖细胞为，在胚胎期的原始生殖细胞达到高峰并减少，出生后维持有限数量的卵母细胞，并且通过使一部分细胞周期性活化以维持排卵周期。此种排卵周期的起点为原始卵泡，卵母细胞以受一层扁平状颗粒细胞包围的状态存在于卵巢皮质。并且，在排卵周期中，原始卵泡发育为初级卵泡、次级卵泡、囊状卵泡、格拉夫氏卵泡(成熟卵泡)，并且排卵。然而，目前不知道原始卵泡的维持以及活性化机制的全貌。因此，确立从原始生殖细胞分化为原始卵泡的体外培养法，可能是解析原始卵泡的维持以及活性化机制的方法。进一步地，若能确立此种培养法，则可以在生体内以及体外持续性地形成卵子。

近年来，确立了从原始生殖细胞分化为功能性成熟卵母细胞的培养方法(举例而言，参照专利文献1以及非专利文献1)。

【背景技术文献】

【专利文献】

【专利文献1】国际公开第2017/047799号

【非专利文献】

【非专利文献1】Morohaku K.et al.，″Complete in vitro generation offertile oocytes from mouse primordial germ cells.″，Proc Natl Acad Sci，Vol.113，No.32，p9021-9026，2016.

发明内容

然而，在专利文献1以及非专利文献1记载的方法中，并未确认原始卵泡的形成，且功能性卵子的形成是瞬间性的。

本发明是鉴于上述事项而完成，且提供一种在体外将原始生殖细胞分化为原始卵泡的方法。

发明人为了达成上述目的而努力进行研究的结果，发现通过在加压条件或低氧气浓度条件下培养原始生殖细胞以及邻接于所述原始生殖细胞的支持细胞，可以形成原始卵泡，据此完成本发明。

此即，本发明包含以下样态。

根据本发明的第1样态的方法为一种在体外将原始生殖细胞分化为原始卵泡的方法，所述方法为将原始生殖细胞以及邻接于所述原始生殖细胞的支持细胞在加压条件下或低氧气浓度下培养的方法。

在根据上述第1样态的方法中，所述培养可以在加压条件下以及低氧气浓度下进行。

在根据上述第1样态的方法中，所述培养可以在PI3激酶抑制剂存在下进行。

在根据上述第1样态的方法中，所述PI3激酶抑制剂可以为Y294002。

在根据上述第1样态的方法中，所述培养可以在排除雌性激素或与所述雌性激素具有类似功能的因子的条件下进行。

在根据上述第1样态的方法中，所述低氧气浓度条件可以为，在培养环境中的氧气浓度在7％以下的条件。

在根据上述第1样态的方法中，所述低氧气浓度条件可以为，在培养环境中的氧气浓度在3％以上7％以下的条件。

在根据上述第1样态的方法中，所述加压条件可以为，23kPa以上40kPa以下的条件。

在根据上述第1样态的方法中，所述加压条件可以为，28kPa以上38kPa以下的条件。

在根据上述第1样态的方法中，获得的所述原始卵泡可以满足以下的(1)以及(2)的条件：

(1)卵母细胞受扁平状的颗粒细胞包围；

(2)在所述卵母细胞的细胞核内，局部存在具有将卵泡的成熟维持在休止期的功能的转录因子。

在根据上述第1样态的方法中，所述转录因子可以为Foxo3a。

在根据上述第1样态的方法中，获得的所述原始卵泡可以进一步满足以下的(3)的条件：

(3)直径为20μm以下。

【发明的效果】

根据上述样态的方法，可以在体外将原始生殖细胞分化为原始卵泡。

附图说明

【图1】a～d为在参考例1中，出生后3.5日龄的雌性小鼠的生殖腺切片的免疫染色图。比例尺为10μm。a为使用针对生殖细胞标记的小鼠Vasa同源物(Mouse Vasa homolog，MVH)的抗体的免疫染色图。b为使用针对细胞外基质的纤粘蛋白的抗体的免疫染色图。c为使用与应力纤维的纤维状肌动蛋白(F-actin)特异性结合的Alexa Fluor 488标记的鬼笔环肽(Phalloidin)的免疫染色图。并且，d为将通过4′，6-二脒基-2-苯基吲哚(4′，6-diamidino-2-phenyl-indole，DAPI)的细胞核染色图叠加在a～c的免疫染色图上的图像。并且，a′～d′各自为a～d内以四角形框起部分的放大图。比例尺为10μm。e～h为在参考例1中受精后12.5日龄的雌性小鼠的生殖腺切片的免疫染色图。比例尺为10μm。e为使用针对生殖细胞标记的MVH的抗体的免疫染色图。f为使用针对细胞外基质的纤粘蛋白的抗体的免疫染色图。g为使用针对应力纤维的纤维状肌动蛋白(F-actin)的抗体的免疫染色图。并且，h为将通过DAPI的细胞核染色图叠加在a～c的免疫染色图上的图像。并且，e′～h′各自为e～h内以四角形框起部分的放大图。

【图2】a～c为在实施例1中，将受精后12.5日龄的雌性小鼠的生殖腺在加压条件下培养，且从开始培养的第21日采集的生殖腺切片的免疫染色图。a为使用针对生殖细胞标记的MVH的抗体的免疫染色图。b为使用针对转录因子Foxo3a的抗体的免疫染色图。c为将通过DAPI的细胞核染色图叠加在a以及b的免疫染色图上的图像。比例尺为10μm。

【图3】在实施例1中，将受精后12.5日龄的雌性小鼠的生殖腺在常态状态(控制组，Control)以及在加压条件下(Pressured)培养，在开始培养第21日采集的生殖腺切片通过萤光立体显微镜的影像。通过在卵母细胞标记Stella的表现调控下表现的青色萤光蛋白质(cyan fluorescent protein，CFP)的萤光，使卵母细胞可视化。比例尺为50μm。

【图4A】在实施例1中，在生理食盐水(PBS)、蛋白质分解酵素处理(CTK)、以及在加压条件下的蛋白质分解酵素处理(CTK(P))中进行固定1小时的出生后7.5日龄的雌性小鼠的生殖腺的免疫染色图。a、e以及i为使用针对在生殖细胞标记Stella的表现调控下表现的CFP的抗体的免疫染色图。b、f以及j为使用针对转录因子Foxo3a的抗体的免疫染色图。c、g以及k为使用针对生殖细胞标记的MVH的抗体的免疫染色图。d为将通过DAPI的细胞核染色图叠加在a～c的染色图上的图像。h为将通过DAPI的细胞核染色图叠加在e～g的染色图上的图像。l为将通过DAPI的细胞核染色图叠加在i～k的染色图上的图像。比例尺为10μm。

【图4B】在实施例1中，在生理食盐水(PBS)、蛋白质分解酵素处理(CTK)、以及在加压条件下的蛋白质分解酵素处理(CTK(P))中进行固定1小时的出生后7.5日龄的雌性小鼠的生殖腺中，显示细胞核内局部存在转录因子Foxo3a的卵母细胞的比例的图表。

【图5】a～c为在实施例2中，将受精后12.5日龄的雌性小鼠的生殖腺在低氧气浓度条件下培养，且从开始培养的第21日采集的生殖腺切片的免疫染色图。a为使用针对生殖细胞标记的MVH的抗体的免疫染色图。b为使用针对转录因子Foxo3a的抗体的免疫染色图。c为将通过DAPI的细胞核染色图叠加在a以及b的免疫染色图上的图像。比例尺为10μm。

【图6A】在参考例2中培养受精后12.5日龄的雌性小鼠的生殖腺，且从开始培养的第6日开始，在培养基中添加PI3K抑制剂的LY2914002(以下也会简称为「Ly」)，从开始培养的第16日采集的生殖腺通过萤光立体显微镜的影像。上段的图为明视野影像，中段的图为萤光影像，下段的图为中段的图的各别放大图。通过在卵母细胞标记Stella的表现调控下表现的CFP的萤光，使卵母细胞可视化。比例尺为50μm。

【图6B】使用上述图6A所示的萤光影像，通过Stella-CFP的表现作为指标，计算卵母细胞的个数而算出的显示各尺寸卵母细胞的比例的图表。

【图7】在实施例3中培养受精后12.5日龄的雌性小鼠的生殖腺，且从开始培养第6天开始添加Ly，进一步在加压条件下(加压(Press)(33.3kPa))培养，从开始培养的第16日采集的生殖腺切片的免疫染色图。a以及e为使用针对在生殖细胞标记Stella的表现调控下表现的CFP的抗体的免疫染色图。b以及f为使用针对转录因子Foxo3a的抗体的免疫染色图。c以及g为使用针对生殖细胞标记的MVH的抗体的免疫染色图。d为将通过DAPI的细胞核染色图叠加在a～c的染色图上的图像。h为将通过DAPI的细胞核染色图叠加在e～g的染色图上的图像。比例尺为10μm。

【图8A】通过分析图7的b以及f所示的免疫染色图，显示在未达20μm的卵母细胞中，细胞核内局部存在转录因子Foxo3a的卵母细胞的比例的图表。

【图8B】通过分析图7的b以及f所示的免疫染色图，显示在未达20μm的卵母细胞中，细胞质基质局部存在转录因子Foxo3a的卵母细胞的比例的图表。

【图9】在实施例4中，将出生后3.5日龄的卵巢以及受精后12.5日龄的雌性小鼠生殖腺在各条件下培养，从开始培养的第16日采集的生殖腺切片的流式细胞术分析结果图表。上半段为显示细胞大小的前散射光(FSC)与在生殖细胞标记Stella的表现调控下表现的CFP的萤光之间的二维直方图。下半段为显示在CFP表现细胞中FSC分布的直方图。下半段的左侧的「合并(Merge)」为叠加下半段的4个直方图。

具体实施方式

<<在体外将原始生殖细胞分化为原始卵泡的方法》

本实施例的方法是一种在体外将原始生殖细胞分化为原始卵泡的方法，是在加压条件下或低氧气浓度条件下培养原始生殖细胞以及邻接于所述原始生殖细胞的支持细胞的方法。再者，此种培养工艺在以下叙述也会称为「工艺(A)」。

根据本实施例的方法，可以在体外将原始生殖细胞分化为原始卵泡。

在公知的体外培养法中，并未确认原始卵泡的形成，且功能性卵子的形成是瞬间性的。相较于此，根据本实施例的方法，可以有效率地使原始生殖细胞以及邻接于所述原始生殖细胞的支持细胞分化为原始卵泡。并且，相较于难以回到母胎内诱导分化的初级卵泡以及次级卵泡等已经分化的卵泡，原始卵泡可以回到母胎内诱导分化。因此，根据本实施例的方法，可以持续性地形成卵子。再者，此处的「卵泡」由卵细胞以及包围所述卵细胞的体细胞(颗粒细胞以及鞘膜细胞)构成。并且，本实施例的方法有助于解析卵母细胞的维持以及活性化的机制。

再者，在本说明书中，「原始生殖细胞」是预定分化为生殖细胞的细胞，是指经过减数分裂后最终分化为卵子或精子的细胞。

原始生殖细胞可以源自生物体，或是由多能干细胞诱导分化而成的类原始生殖细胞(primordial germ cell like cell，PGCLC)。自生物体回收原始生殖细胞时，举例而言，自雌性小鼠的胚胎(11.5日龄至12.5日龄为止)与生殖腺同时回收。再者，自生物体回收生殖腺时，可以通过伴随中肾回收的形式，也可以切除中肾再回收。

并且，如上所述，在本说明书中，「原始生殖细胞」包含由多能干细胞分化而成的类原始生殖细胞。于此，「多能干细胞」是指具有维持未分化状态且增殖的「自我再生能力」以及可以分化成所有三胚层系列细胞的「分化多能性」的未分化细胞。作为多能干细胞，例如但不限于，人工多能干细胞(iPS细胞)、胚胎干细胞(ES细胞)、源自原始生殖细胞的胚胎生殖细胞(EG细胞)、通过源自精巢组织的GS细胞的建立培养过程分离而得的多能生殖干细胞(multipotent germline stem cell)(mGS细胞)、由骨髓间质细胞分离的Muse细胞等。再者，ES细胞也可以是由体细胞进行细胞核重新编程产生的ES细胞。上述举例的多能干细胞可以各自通过公知的方法获得。

于此所述的「iPS细胞」是指通过将数个基因导入分化后的体细胞，变得可以重新编程为多种组织或器官的细胞的细胞。在本实施例的方法中，用来诱导分化原始生殖细胞的iPS细胞可以源自从适当供体采集的体细胞的初代培养细胞，也可以源自建立细胞株。因为iPS细胞可以诱导分化为任一种胚层系列细胞，因此，用于制备iPS细胞的体细胞原则上可以是源自外胚层系列细胞或内胚层系列细胞的其一胚层系列细胞。侵入性较低且较容易采集的皮肤、头发、牙龈、血液等的细胞为适用于制备iPS细胞的体细胞。关于iPS细胞的制备方法，可依照该领域的公知方法。具体而言，可以利用例如「Okita K.et al.，“Generation of germline-competent induced pluripotent stem cells.”，Nature，Vol.448，p313-317，2007.」(参考文献1)、「Hamanaka S.et al.，“Generation ofgermline-competent rat induced pluripotent stem cells.”，PLoS One，Vol.6，Issue7，e22008，2011.」(参考文献2)等的公知文献记载的制备方法。

并且，在本实施例的方法中，用于诱导分化原始生殖细胞的ES细胞可通过公知的方法获得。举例而言，自对象动物的受精卵的囊胚采集内部细胞块，将所述内部细胞块放置于源自纤维母细胞的滋养细胞上培养，据此建立。另外，也可以使用通过移植体细胞的细胞核而制成的早期胚的培养而建立的ES细胞。

并且，由iPS细胞或ES细胞诱导分化类原始生殖细胞的方法为公知的方法，举例而言，可以参考「Hayashi K.et al.，“Reconstitution of the mouse germ cellspecification pathway in culture by pluripotent stem cells.”，Cell，Vol.146，No.4，p519-532，2011.」(参考文献3)等而进行。

再者，将源自多能干细胞的PGCLC作为原始生殖细胞使用时，从诱导分化的多能干细胞团中预先去除未分化状态的细胞为优选。此种方法为公知的，举例而言，通过将编码有原始生殖细胞的标记基因Blimp1与报导蛋白质结合的融合蛋白质的核酸导入多能干细胞，可以通过荧光激活细胞分选术(Fluorescence-activated cell sorting，FACS)等而简单地从多能干细胞中分离受诱导分化的PGCLC以及未分化的细胞。

于此，本说明书中的「原始生殖细胞」是上述列举的源自生物体的原始生殖细胞或源自多能干细胞的类原始生殖细胞，包含利用基因工程的技术改造所述细胞的基因之后的细胞。

作为改造源自生物体的原始生殖细胞以及源自多能干细胞的类原始生殖细胞的基因的方法为，使用CRISPR系统、类转录激活因子效应物核酸酶(TranscriptionActivator-Like Effector Nucleases，TALEN)的方法、使用锌指核酸酶的方法、使用同源重组等公知的基因体编辑法，可以将目标核酸或载体等导入。作为核酸或载体等的导入法，举例而言，显微注射法(microinjection)、电穿孔法、脂转染法、使用病毒载体的核酸导入法等。并且，只要可以将基因改造后的原始生殖细胞通过本实施例的方法分化为功能性卵母细胞，外来基因或外来核酸片段的导入法并不限于上述列举的方法。

再者，对于原始生殖细胞的基因改造，可以在原始生殖细胞培养期间内的适当时间点进行。举例而言，以小鼠而言，可以在11.5日龄到12.5日龄的期间进行。并且，使用源自多能干细胞的类原始生殖细胞时，也可以通过公知的方法对诱导分化为类原始生殖细胞之前的多能干细胞进行基因改造。

并且，在本说明书中，「支持细胞」是包围原始生殖细胞的细胞，在性分化后的卵巢中，是指分化为颗粒细胞或鞘膜细胞的细胞。因为支持细胞将分化为构成卵泡的颗粒细胞或鞘膜细胞，因此用于原始生殖细胞的共同培养。据此，原始生殖细胞的培养，以生殖腺的原样或以原始生殖细胞与支持细胞邻接的方式共同培养为优选。再者，以源自多能干细胞的PGCLC作为原始生殖细胞使用时，可以使用源自从生物体采集的生殖腺的体细胞作为支持细胞。

再者，使用源自从生物体采集的生殖腺的体细胞作为支持细胞时，在上述工艺(A)之前，优选地，进行制备由源自多能干细胞的PGCLC与源自生殖腺的体细胞构成的凝集块的培养工艺。

再者，采集源自生殖腺的体细胞的方法以及制备由源自多能干细胞的PGCLC与源自生殖腺的体细胞构成的凝集块的方法，可以依据参考文献3记载的方法进行。

举例而言，采集源自生殖腺的体细胞的方法可以从生物体以外科方法采集生殖腺，并通过胰蛋白酶处理等方法分离出构成生殖腺的体细胞。再者，此时，去除源自生物体的生殖腺中内存的生殖细胞为优选。去除源自生物体的生殖腺中内存的生殖细胞的方法可以通过公知的方法进行，举例而言，可以通过使用抗SSEA1抗体或抗CD31抗体的磁激活细胞分离法(Magnetic activated cell sorting)去除源自生物体的生殖腺中内存的生殖细胞。于此，为了作为支持细胞而采集体细胞的生殖腺以源自胚胎为优选。以小鼠的情况而言，举例而言，可以使用源自胎龄(或称为「胚龄」)12.5日的小鼠胚胎的生殖腺。再者，对于本领域技术人员，可以从本说明书及本技术领域的技术常识，根据来源动物物种选择适当优选时期的生殖腺。

再者，制备由源自多能干细胞的PGCLC与源自生殖腺的体细胞构成的凝集块的方法，举例而言，可以在含有视黄酸(Retinoic Acid)的GK15培养基(GMEM中添加15％KSR(KnockOut(注册商标)血清替代物)、1×GlutaMax(注册商标)、1×青霉素(penicillin)/链霉素(streptomycin)(100U/mL的青霉素以及0.1mg/mL的链霉素)、100μM的2-巯基乙醇(2-mercaptoethanol，2ME)、1μM的视黄酸)中混合源自多能干细胞的PGCLC与源自生殖腺的体细胞并使其凝集后进行培养。培养时使用低吸附性的培养盘为优选。

以小鼠的情况举例而言，用于制备凝集块的培养期间可为2日以上3日以下，以2日为优选。再者，对于本领域技术人员，可以根据来源动物物种选择适当的优选培养期间。

再者，源自多能干细胞的PGCLC与源自生殖腺的体细胞混合时的比例为，只要制备而成的凝集块可以形成原始卵泡则无限定，例如以小鼠的情况而言，源自多能干细胞的PGCLC与源自生殖腺的体细胞的细胞数目比以1∶10为优选。

再者，包含原始生殖细胞或支持细胞、或是包含原始生殖细胞以及支持细胞的生殖腺，可以使用冷冻保存的生殖腺。冷冻保存方法可以通过公知的方法进行。举例而言，原始生殖细胞或支持细胞的冷冻保存可以使用10％DMSO溶液或市售的冷冻剂(CELLBANKER(注册商标))通过缓慢冷冻法等进行。

再者，本实施例的方法中所用的原始生殖细胞是使用源自哺乳动物的原始生殖细胞。作为哺乳动物，例如但不限于，人、黑猩猩以及其他灵长类；狗、猫、兔、马、绵羊、山羊、牛、猪、大鼠(也包含裸大鼠)、小鼠(也包含裸小鼠以及重症联合免疫缺陷小鼠)、仓鼠、天竺鼠等的家畜动物、宠物以及实验用动物等，且并不限于这些动物。

接着，以下详细说明本实施例的方法的工艺。

<工艺(A)>

在工艺(A)中，原始生殖细胞以及邻接于所述原始生殖细胞的支持细胞在加压条件下或低氧气浓度条件下培养，以形成原始卵泡。并且，在工艺(A)中，使用自生物体采集的生殖腺的情况，不需要自生殖腺分离原始生殖细胞以及支持细胞，可以通过生殖腺的原样、或分离后的原始生殖细胞与支持细胞的凝集块、或是数个组织切片的方式培养。

并且，在本说明书中，在工艺(A)中提到「原始生殖细胞以及邻接于所述原始生殖细胞的支持细胞的培养」时，包含培养含有原始生殖细胞以及支持细胞的生殖腺、分离后的原始生殖细胞与支持细胞的凝集块、或是其一部分。再者，只要可以获得原始卵泡，也可以从生殖腺分离并培养原始生殖细胞以及支持细胞。并且，使用源自多能干细胞的类原始生殖细胞的情况，如上所述，预先制备由源自多能干细胞的PGCLC与源自生殖腺的体细胞构成的凝集块为优选。

具体而言，作为加压条件，对于含有包含原始生殖细胞或支持细胞、或是包含原始生殖细胞以及支持细胞的生殖腺的培养液施加23kPa以上40kPa以下的静水压条件为优选，施加28kPa以上38kPa以下的静水压条件为较优选，施加30kPa以上35kPa以下的静水压条件为更优选，施加32kPa以上34kPa以下的静水压条件尤为优选。

通过施加上述范围内的静水压，可以更有效地使原始生殖细胞分化为原始卵泡。

并且，作为加压方法，举例而言，如后述实施例的记载，使用STREX公司的AGP-3001S(注册商标)等的市售加压培养装置的方法等。

具体而言，作为低氧气浓度条件，培养环境中的氧气浓度在7％以下的条件为优选，在3％以上7％以下的条件为较优选，在4％以上6％以下的条件为更优选，在5％的条件尤为优选。

通过上述范围内的氧气浓度，可以更有效地使原始生殖细胞分化为原始卵泡。

并且，作为低氧气浓度条件下的培养方法，举例而言，如后述实施例的记载，使用Astec公司制的APM30D等市售可调整氧气浓度的培养器的培养方法等。

作为加压条件以及低氧气浓度条件的开始时机，可以从原始生殖细胞以及邻接于所述原始生殖细胞的支持细胞的培养起始时间点开始，也可以配合原始卵泡开始形成的时期从培养的途中开始。

再者，在工艺(A)中，培养温度可为，例如25℃以上40℃以下，例如30℃以上37℃以下。

从原始生殖细胞形成原始卵泡的培养期间为，根据培养的原始生殖细胞的来源动物物种而异，优选地，以原始生殖细胞在生物体内形成原始卵泡为止的期间为基准。以培养小鼠的原始生殖细胞的情况而言，以相当于出生后10日龄前后的培养日数为优选。举例而言，从胎龄12.5日的雌性小鼠胚胎采集原始生殖细胞开始培养的情况，以14日以上21日以下为优选、以16日以上21日以下为较优选、以18日以上21日以下为更优选。并且，培养源自小鼠的多能干细胞的PGCLC与体细胞的凝集块时，以从预先制备的凝集块开始培养起算的11日以上21日以下为优选。

所用的培养基可以使用公知的基本培养基，举例而言，α-MEM、PRMI1640、199、StemPro(注册商标)-34SFM等，可以在这些基本培养基中添加血清或血清替代物使用。然而，作为工艺(A)使用的基本培养基，只要可以使原始生殖细胞分化为原始卵泡，则不限于上述列举的基本培养基。再者，只要不妨碍原始生殖细胞分化为原始卵泡，可以在基本培养基适当地包含抗坏血酸或青霉素等其他成分。

并且，在培养原始生殖细胞形成原始卵泡时，可以组合使用两种以上的上述列举基本培养基。举例而言，在培养原始生殖细胞形成原始卵泡的前半培养时期使用α-MEM作为基本培养基、后半培养时期使用StemPro(注册商标)-34SFM作为基本培养基。再者，虽然基本上可以通过使用单一基本培养基达到从原始生殖细胞形成原始卵泡，但是，通过改变所用的基本培养基，更能促进颗粒细胞的增殖，在分离形成的原始卵泡时较不易破坏卵泡构造，因此为优选。此种更能促进颗粒细胞增殖的效果，在从源自多能干细胞的PGCLC与源自生殖腺的体细胞之细胞凝集块形成原始卵泡的情况尤为所期望。举例而言，在源自小鼠的多能干细胞的PGCLC与源自生殖腺的体细胞之细胞凝集块的培养中使用α-MEM以及StemPro(注册商标)-34SFM两种基本培养基的情况，从凝集块开始培养后的第4日起至第8日为止，可以从α-MEM更换至StemPro(注册商标)-34SFM，在开始培养后的第4日为较优选。并且，培养源自小鼠生殖腺的原始生殖细胞的情况，也可以在相同的时期更换培养基。

并且，虽然如上所述地列举了培养温度、培养期间以及使用的培养基，但是，本领域技术人员可以根据来源动物物种设定适当的优选培养温度、培养期间以及使用的培养基种类。

并且，在工艺(A)的原始生殖细胞培养，以在6孔培养盘等的培养盘中使用Transwell-COL薄膜等的公知插入式薄膜为优选。并且，在培养期间内，用于培养的培养基以每隔1日更换约一半的量为优选。关于培养盘或插入式薄膜、培养基更换的时间点等，本领域技术人员可以根据培养的原始生殖细胞的来源动物物种等适当设定实施条件。

并且，在本实施例的方法中，也可以在加压条件下以及低氧气浓度条件下进行工艺(A)。据此，可以更有效地使原始生殖细胞分化为原始卵泡。并且，如后述实施例所示，相较于在加压条件下或低氧气浓度条件下培养的情况，尺寸较小的卵母细胞的比例有增加的倾向。

并且，在本实施例的方法中，除了在加压条件下或低氧气浓度条件下进行工艺(A)之外，可以进一步在PI3激酶抑制剂存在下进行。

再者，一般而言，「PI3激酶(phosphatidylinositol-3kinase，PI3K)」为介导细胞膜构成成分的肌醇磷脂质在肌醇环3位磷酸化反应的脂质激酶。在哺乳类中分为1A类、1B类、2类以及3类的4种亚型。近年指出，通过PI3K信号的活性化，卵母细胞逐渐成熟(参考文献4：「Li J et al.，“Activation of dormant ovarian follicles to generate matureeggs.”，PNAS，Vol.107，No.22，p10280-10284，2010.」)。

发明人在工艺(A)通过配合加压条件以及添加PI3激酶抑制剂，如后述实施例所示，得知可以更有效率地使原始生殖细胞分化为原始卵泡。

作为PI3K抑制剂，举例而言，阻碍PI3K的功能。具体而言，作为PI3K抑制剂，例如，低分子化合物、PI3K表现抑制剂、PI3K特异性结合物质等。

作为PI3K抑制剂的低分子化合物，例如但不限于，皮克立西(Pictilisib)(GDC-0941)(CAS编号957054-30-7)、LY294002(CAS编号154447-36-6)、艾德昔布(Idelalisib)(CAL-101，GS-1101)(CAS编号870281-82-6)、布帕昔布(Buparlisib)(BKM120，NVP-BKM120)(CAS编号944396-07-0)、PI-103(CAS编号371935-74-9)、TGX-221(CAS编号663619-89-4)、IC-87114(CAS编号371242-69-2)、渥曼青霉素(Wortmannin)(CAS编号19545-26-7)等。

作为PI3K表现抑制剂，举例而言，siRNA、shRNA、miRNA、核酶、反义核酸、低分子化合物等。通过施加这些PI3K表现抑制剂，使PI3K的表现量下降，可以抑制PI3K讯号。据此，可以抑制卵母细胞的成熟，再通过配合加压条件以及低氧气条件中的至少一种，可以在原始生殖细胞诱导分化为原始卵泡的同时，维持原始卵泡的状态。

siRNA(小干扰RNA，small interfering RNA)为21对碱基对以上23对碱基对以下的小分子双股RNA，用于通过RNA干扰进行基因静默。导入细胞内的siRNA与RNA诱导静默复合体(RISC)结合。此复合体结合至与siRNA具有互补序列的mRNA并切断所述mRNA。据此，序列特异性地抑制基因的表现。

siRNA的有义股以及反义股寡核苷酸各别由DNA/RNA自动合成机合成，举例而言，在适当的黏合缓冲液中，经过90℃以上95℃以下约1分钟的变性后，可以通过在30℃以上70℃以下约1小时以上8小时以下的黏合而制备。

为了增进siRNA、shRNA、miRNA、核酶以及反义核酸的安定性或活性、可以包含各种化学修饰。举例而言，为了避免受核酸酶等的加水分解酵素分解，可以将磷酸残基替换为例如硫代磷酸酯(PS)、甲基膦酸酯、二硫代磷酸酯等的化学修饰磷酸残基。并且，至少一部分可以由肽核酸(PNA)等的核酸类似物构成。

作为PI3K特异性结合物质，举例而言，与PI3K特异性结合进而抑制PI3K的功能，例如，抗体、抗体片段、适配体等。举例而言，抗体可以通过小鼠等动物以PI3K蛋白质或其片段作为抗原进行免疫反应而制备。或者，举例而言，可以通过筛选噬菌体库而制备。作为抗体片段，举例而言，Fv、Fab、scFv等。上述的抗体，以单克隆抗体为优选。并且，可以为市售的抗体。

适配体为，对于目标物质具有特异性结合能力的物质。作为适配体，举例而言，核酸适配体、肽适配体等。具有与目标肽特异性结合能力的核酸适配体，举例而言，可以通过指数富集的适配体系统进化技术(systematic evolution of ligand by exponentialenrichment，SELEX)筛选。

作为PI3K抑制剂的添加量，可以对应于所用的抑制剂种类而适当选择，举例而言，在低分子化合物(尤其是LY294002)的情况，可以为培养基最终浓度的0.01μM以上300μM以下，也可以为0.1μM以上100μM以下。通过在上述范围内的PI3K抑制剂添加量，可以更有效地抑制卵母细胞的成熟。

作为PI3K抑制剂的添加时间点，可以从原始生殖细胞以及邻接于所述原始生殖细胞的支持细胞的培养起始时间点开始，也可以配合原始卵泡开始形成的时期从培养的途中开始。

并且，在本实施例的方法中，除了在加压条件下或低氧气浓度条件下进行工艺(A)，也可以进一步在排除雌性激素或与所述雌性激素具有类似功能的因子的条件下进行。

再者，在本说明书中，「雌性激素」是指性类固醇激素的一种，在卵巢的颗粒细胞中由雄性激素代谢而产生。释出的雌性激素通过与雌性激素受体结合，活化特定基因的转录。已知雌性激素分为雌酮(E1)、雌二醇(E2)以及雌三醇(E3)三种，在本说明书中提到的雌性激素包含上述三种。并且，在本说明书中，「性类固醇激素」除了雌性激素以外，包含睾酮、双氢睾酮、雄固酮等的雄性激素。

并且，在本说明书中，提到「与雌性激素具有类似功能的因子」或是「与性类固醇激素具有类似功能的因子」时，是指所述因子具有与雌性激素或性类固醇激素相同或类似的功能。

并且，在本说明书中，提到「与雌性激素类似的功能」或是「与性类固醇激素类似的功能」时，是指在体外培养原始生殖细胞时的以下(i)或(ii)。

(i)源自原始生殖细胞的卵母细胞中，抑制卵母细胞囊肿崩解的功能；

(ii)抑制原始卵泡形成的功能中的至少一个功能。

作为此种与雌性激素或性类固醇激素具有类似功能的因子，举例而言，与雌性激素或雄性激素等的性类固醇激素受体结合的因子，具体而言，例如培养基中的酚红等。再者，因为血清中除了雌性激素或雄性激素以外，也可能含有其他未确认的与雌性激素具有类似功能的因子，因此，排除此种与雌性激素或性类固醇激素具有类似功能的因子的影响的培养条件为优选。再者，此述的「卵母细胞囊肿」是指在胚胎时期通过不完全的细胞质分裂产生的通过细胞间桥体联系的状态。

于此，「排除性类固醇激素的影响(举例而言，雌性激素或与雌性激素具有类似功能的因子)的影响的条件下」的培养包含存在「性类固醇激素抑制剂」的培养。并且，作为其一例示，包含存在「雌性激素抑制剂」的培养。再者，「性类固醇激素抑制剂」除了雌性激素抑制剂或雄性激素抑制剂以外，也包含雄性激素抑制剂与雌性激素抑制剂的组合。在本实施例的方法中所用的「雌性激素抑制剂」或「性类固醇激素抑制剂」具有抑制雌性激素受体或性类固醇激素抑制剂受体的活化的功能。

具体而言，作为所述抑制剂，举例而言，包含雌性激素的拮抗剂、ICI 182，780((7R，9S，13S，14S，17S)-7-(9-(4，4，5，5，5-五氟戊基亚硫酰基)壬基)-7，8，9，11，12，13，14，15，16，17-十氢-13-甲基-6H-环戊烷并[a]菲-3，17-二醇)((7R，9S，13S，14S，17S)-7-(9-(4，4，5，5，5-Pentafluoropentylsulfinyl)nonyl)-7，8，9，11，12，13，14，15，16，17-decahydro-13-methyl-6H-cyclopenta[a]phenanthrene-3，17-diol)。并且，具体而言，作为同样抑制剂，举例而言，可以使用他莫昔芬柠檬酸盐(Tamoxifen citrate)、4-羟基他莫昔芬(4-Hydroxytamoxifen)、MPP(4-[1-(4-羟苯基)-4-甲基-5-[4-[2-(1-哌啶基)乙氧气基]苯基]-1H-吡唑-3-基]-苯酚)(4-[1-(4-hydroxyphenyl)-4-methyl-5-[4-[2-(1-piperidinyl)ethoxy]phenyl]-1H-pyrazol-3-yl]-phenol)、PHTPP(4-[2-苯基-5，7-双(三氟甲基)吡唑并[1，5-a]吡啶-3-基]苯酚)(4-[2-Phenyl-5，7-bis(trifluoromethyl)pyrazolo[1，5-a]pyrimidin-3-yl]phenol)、G15((3aS，4R，9bR)-4-(6-溴-1，3-苯并二氧气戊环-5-基)-3a，4，5，9b-3H-环戊并[c]喹啉)((3aS，4R，9bR)-4-(6-Bromo-1，3-benzodioxol-5-yl)-3a，4，5，9b-3H-cyclopenta[c]quinoline)等市售的抑制剂。

并且，举例而言，在性类固醇激素抑制剂中，作为雄性激素受体抑制剂，可以使用KW-365(N-[4-[(苄基)(4-硝基苯基)胺]-1-甲基吡咯-2-羰基)]吡咯啶)(N-[4-[(Benzyl)(4-nitrophenyl)amino]-1-methylpyrrole-2-carbonyl]pyrrolidin e)等市售的抑制剂。作为雌性激素或性类固醇激素抑制剂，不限于上述抑制剂，只要具有可以抑制雌性激素或性类固醇激素受体活性化的作用，并且可以使原始生殖细胞分化为原始卵泡即可使用。

再者，通过添加雌性激素或性类固醇激素抑制剂造成的雌性激素或性类固醇激素受体活性抑制，可以视为抑制卵母细胞囊肿崩解以及原始卵泡形成之中的至少一种。据此，相较于在卵母细胞囊肿崩解以及原始卵泡形成之中的至少一种进行的时间点，在之前的时间点添加雌性激素抑制剂为优选。并且，不需要从原始生殖细胞以及邻接于所述原始生殖细胞的支持细胞的培养起始时间点就开始在「排除性类固醇激素的影响(举例而言，雌性激素或与雌性激素具有类似功能的因子)条件下」培养，在卵母细胞囊肿崩解以及原始卵泡形成之中的至少一种进行的时期，在「排除性类固醇激素的影响(举例而言，雌性激素或与雌性激素具有类似功能的因子)条件下」培养为优选。

以下，以使用雌性激素抑制剂作为性类固醇激素抑制剂，且使用小鼠作为动物物种为例进行说明。举例而言，以小鼠而言，从17.5日龄开始到出生前后，多数的卵母细胞囊肿开始崩解。据此，在相当于此胎龄时期的培养日数的日期添加为优选。再者，在胎龄12.5日采集生殖腺，且从采集日开始培养原始生殖细胞的情况，体外培养第5日视为相当于胎龄第17.5日。并且，在含有雌性激素抑制剂的培养基中的培养期间，以结束卵母细胞囊肿崩解以及原始卵泡形成的期间为优选。培养小鼠的原始生殖细胞时，从培养第5日至培养第11日的6日期间为优选，但不限于此期间。并且，培养源自小鼠的多能干细胞的PGCLC与体细胞之细胞凝集块时，以预先制备的凝集块的培养起算的培养第7日至培养第10日的4日期间为优选，但不限于此期间。

再者，虽然以小鼠为例说明，本领域技术人员可以考虑所用各种动物物种的卵母细胞囊肿崩解以及原始卵泡形成的时期，适当设定「雌性激素抑制剂」的培养期间。并且，不限于使用「雌性激素抑制剂」，「排除性类固醇激素的影响(举例而言，雌性激素或与雌性激素具有类似功能的因子)条件下」的培养期间，以结束卵母细胞囊肿崩解以及原始卵泡形成的期间为优选。再者，在所述条件下的培养，只要能够获得功能性卵母细胞，可以在卵母细胞囊肿崩解起始时开始，并且，可以在原始卵泡形成完全结束前停止。

雌性激素抑制剂或性类固醇激素抑制剂可以添加在用于培养原始生殖细胞的公知基本培养基中使用。作为此种基本培养基，举例而言，与上述例示的基本培养基相同。

再者，培养小鼠的原始生殖细胞时，作为雌性激素抑制剂，举例而言，使用ICI182，780的情况，在培养基中添加0.01μM以上50μM以下(最终浓度)的范围为优选，0.1μM以上10μM以下(最终浓度)的范围为较优选。再者，本领域技术人员可以根据原始生殖细胞的来源动物物种或所用的基本培养基、所用的雌性激素抑制剂等，调整使用适当雌性激素抑制剂的添加时间点或浓度。再者，未添加雌性激素抑制剂的培养期间，可以使用上述例示的基本培养基培养。

并且，作为「排除性类固醇激素的影响(举例而言，雌性激素或与雌性激素具有类似功能的因子)条件下」培养的其他方法，举例而言，在无血清培养基中培养。于此，无血清培养基可以是公知的无血清培养基(举例而言，如同StemPro(注册商标)-34SFM，可以直接使用的已制备无血清培养基)，或者，也可以是使用血清替代物制备的无血清培养基。

使用血清替代物制备无血清培养基时，举例而言，可以将SPS(血清蛋白替代物，Serum Protein Substitute)、KSR、SSS(血清替代补充物，serum substitute supplement)(注册商标)等的市售血清替代物替代胎牛血清(Fetal bovine serum，FBS)，添加至基本培养基中制备。作为血清替代物，以SPS或KSR为优选。

作为用于制备无血清培养基的基本培养基，举例而言，与上述例示的基本培养基相同。然而，作为用于工艺(A)的基本培养基，只要原始生殖细胞可以分化为原始卵泡，则不限于上述例示。

再者，在培养小鼠的原始生殖细胞时，作为排除性类固醇激素的影响(举例而言，雌性激素或与雌性激素具有类似功能的因子)的培养条件，举例而言，使用SPS替代FBS等的血清的情况，在培养基中添加5％以上20％以下(最终浓度)的范围为优选，10％(最终浓度)为较优选。再者，本领域技术人员可以根据原始生殖细胞的来源动物物种或所用的基本培养基、所用的血清替代物等，调整使用适当血清替代物的浓度。

并且，在使用无血清培养基进行培养的期间，以结束卵母细胞囊肿崩解以及原始卵泡形成的期间为优选。并且，在工艺(A)的原始生殖细胞培养期间内，可以自始至终使用无血清培养基。

再者，本领域技术人员可以根据原始生殖细胞的来源动物物种或所用的无血清培养基，调整使用从适当血清培养基更换至无血清培养基的时间点。再者，在未使用无血清培养基的培养期间，在上述列举的基本培养基内加入FBS等的血清的培养基中培养为优选，如上所述，也可以自始至终使用无血清培养基培养。再者，只要不妨碍原始生殖细胞分化为原始卵泡，基本培养基也可以适当地包含抗坏血酸或青霉素等其他成分。

并且，使用本实施例的方法获得的原始卵泡，以满足以下(1)以及(2)的条件为优选。

(1)卵母细胞受扁平状的颗粒细胞包围；

(2)在上述卵母细胞的细胞核内，局部存在具有将卵泡的成熟维持在休止期的功能的转录因子。

通过满足上述条件，可以评估为更接近生体内形成的原始卵泡。

作为具有将卵泡的成熟維持在休止期功能的轉錄因子，舉例而言，Foxo3a(也称为Fkhr2、C76856、FKHRL1、1110048B16Rik、2010203A17Rik等)等。

并且，使用本实施例的方法获得的原始卵泡，除了上述(1)以及(2)的条件以外，以进一步满足以下(3)的条件为优选。

(3)直径为20μm以下。

再者，关于上述(1)以及上述(3)的条件，举例而言，可以使用显微镜等通过目视评估。并且，关于上述(1)的条件，可以通过使用针对颗粒细胞表现的蛋白质(举例而言，纤粘蛋白等)的抗体的免疫染色等评估。

关于上述(2)的条件，举例而言，可以通过使用针对上述转录因子的抗体(举例而言，抗Foxo3a抗体)的免疫染色等评估。并且，为了确认局部存在于细胞核内，必要时，举例而言，上述免疫染色可以组合使用市售的细胞核染色试剂(举例而言，4′，6-二脒基-2-苯基吲哚(4′，6-diamidino-2-phenyl-indole，DAPI))。

<使用用途>

使用本实施例方法获得的原始卵泡，适用于治疗不孕。此即，在其一实施例中，本发明使用通过上述方法获得的原始卵泡，提供治疗不孕的方法。

并且，通过使用本实施例的方法获得的原始卵泡，适用于经济动物的有效育种以及濒危动物的繁殖。此即，在其一实施例中，本发明使用通过上述方法获得的原始卵泡，提供经济动物的育种方法以及濒危动物的繁殖方法。

再者，作为上述适用对象的动物，以哺乳动物为优选。作为哺乳动物，举例而言，与上述例示相同。

并且，通过使用本实施例的方法获得的原始卵泡，有助于探究不孕原因以及停经病症的机制。

【实施例】

以下通过实施例说明本发明，但本发明并不限于以下实施例。

<实验材料>

在下述实施例中使用的所有动物，都是从日本SLC株式会社购入。并且，12.5日龄的雌性小鼠为，通过C57BL/6Stella-CFP基因转殖雄性小鼠与ICR雌性小鼠交配而获得。并且，所有试验都获得九州大学动物实验委员会的许可。

[参考例1]在小鼠生物体内确认原始卵泡的形成过程

首先，在生物体内确认原始卵泡的形成过程。

(1)制作组织切片

分别从出生后3.5日龄的雌性小鼠以及雌性小鼠胚胎(受精后12.5日龄)摘出生殖腺，制作冷冻切片。具体而言，将生殖腺浸泡在含有4％多聚甲醛(paraformaldehyde)的PBS中，在4℃进行固定处理3小时。接着以10％、15％、20％的蔗糖梯度处理，以O.C.T化合物(Tissue-Tek公司制)包埋并冷冻。接着，以冷冻的生殖腺制作7μm厚的切片。

(2)免疫染色

接着，将通过(1)获得的生殖腺的组织切片浸泡在含有200倍稀释的小鼠抗Ddx4/MVH多克隆抗体(abcam公司制)以及500倍稀释的兔抗纤粘蛋白抗体(Sigma公司制)的溶液中，在4℃过夜进行一次抗体抗原反应。接着，去除各种一级抗体溶液，以PBS洗净后，将生殖腺的组织切片浸泡在各含有500倍稀释的Alexa Fluor 647标记的抗小鼠IgG抗体的溶液(分子探针、莱富生命科技公司制)以及含有500倍稀释的Alexa Fluor Plus 555标记的抗兔IgG抗体的溶液中，在室温进行二级抗原抗体反应3小时。接着，去除各种二级抗体溶液，以PBS洗净后，将生殖腺的组织切片浸泡在含有1000倍稀释的Alexa Fluor 488标记的鬼笔环肽(Phalloidin)的溶液中，在室温进行反应1小时。进一步，以PBS洗净后，将生殖腺的组织切片使用4′，6-二脒基-2-苯基吲哚(4′，6-diamidino-2-phenyl-indole，DAPI)(和光纯药工业公司制)染色。

(3)观察

在共聚焦显微镜(卡尔·蔡司公司制，型号Zeiss LSM 700)下观察通过(2)免疫染色的生殖腺的组织切片。结果如图1所示。在图1中，a～d为出生后3.5日龄的雌性小鼠的生殖腺切片的免疫染色图。比例尺为10μm。a为使用针对生殖细胞标记的MVH的抗体的免疫染色图。b为使用针对细胞外基质的纤粘蛋白的抗体的免疫染色图。c为使用针对应力纤维的纤维状肌动蛋白(F-actin)的抗体的免疫染色图。并且，d为将通过DAPI的细胞核染色图叠加在a～c的免疫染色图上的图像。并且，a′～d′各自为a～d内以四角形框起部分的放大图。比例尺为10μm。e～h为受精后12.5日龄的雌性小鼠的生殖腺切片的免疫染色图。比例尺为10μm。e为使用针对生殖细胞标记的MVH的抗体的免疫染色图。f为使用针对细胞外基质的纤粘蛋白的抗体的免疫染色图。g为使用针对应力纤维的纤维状肌动蛋白(F-actin)的抗体的免疫染色图。并且，h为将通过DAPI的细胞核染色图叠加在a～c的免疫染色图上的图像。并且，e′～h′各自为e～h内以四角形框起部分的放大图。

由图1的a～d以及a′～d′，在出生后3.5日龄的雌性小鼠生殖腺内，确认存在受一层扁平状的颗粒细胞覆盖的原始卵泡，且其周围有发达的细胞外基质。

另一方面，由图1的e～h以及e′～h′，在受精后12.5日龄的雌性小鼠生殖腺内，原始生殖细胞的周围确认不具有发达的细胞外基质。

此发达的细胞外基质与应力纤维的纤维状肌动蛋白的堆积一致。

[实施例1]将原始生殖细胞在加压条件下进行体外培养

接着，尝试在体外培养系统中，在人为加压条件下培养12.5日龄的雌性小鼠生殖腺。

(1)制备生殖腺以及培养基

作为用于体外培养的培养基，制备以αMEM(Gibco、莱富生命科技公司)为基本培养基，且在αMEM中添加2％胎牛血清(Fetal bovine serum，FBS)、55μM的2-巯基乙醇(2-mercaptoethanol，2ME)(Gibco、莱富生命科技公司)、1×青霉素(penicillin)/链霉素(streptomycin)(Gibco、莱富生命科技公司)以及1×GlutaMax(注册商标)(Gibco、莱富生命科技公司)的培养基(以下也会将所述培养基称为「αM2」)，并且，制备以StemPro(注册商标)(Gibco、莱富生命科技公司)为基本培养基，且在StemPro中添加10％的FBS、55μM的2ME(Gibco、莱富生命科技公司)、1×青霉素(penicillin)/链霉素(streptomycin)(Gibco、莱富生命科技公司)以及1×GlutaMax(注册商标)(Gibco、莱富生命科技公司)的培养基(以下也会将所述培养基称为「S10」)。

并且，用于培养的生殖腺，是从雌性小鼠胚胎(受精后12.5日龄)或出生后7.5日龄的雌性小鼠中，以不伴随中肾的状态下采集。

(2)生殖腺的体外培养

接着，使用通过(1)制备的培养基，在人为加压条件下培养从12.5日龄的雌性小鼠采集的生殖腺。

具体而言，首先，在6孔培养盘的各孔中，设置Transwell-COL薄膜(孔径3.0μm、直径24mm)(康宁公司制)，将通过(1)采集的生殖腺承载于薄膜上。接着，对各孔添加1.3mL的培养基，培养21日。人为加压为，使用STREX公司的AGP-3001S(注册商标)施加33.33kPa的静水压。并且，培养基为，通过αM2培养4日，再以S10培养。并且，从开始培养的第5日至第9日期间，在培养基中添加最终浓度为500nM的雌性激素受体拮抗剂的ICI182，780(7α，17β-[9-[(4，4，5，5，5-五氟戊基)亚硫酰基]壬基]雌甾-1，3，5(10)-三烯-3，17-二醇)(7α，17β-[9-[(4，4，5，5，5-pentafluoropentyl)sulfinyl]nonyl]estra-1，3，5(10)-triene-3，17-diol)(Tocris Bioscience公司制)。再者，每隔1日更换约一半份量的新培养基。并且，作为对照，也制备不加压的相同培养物(常态状态下的培养物)。

(3)制作组织切片

将通过(2)培养的生殖腺，使用与参考例1的(1)相同的方法，制作生殖腺的组织切片。

(4)免疫染色

接着，将通过(3)获得的生殖腺的组织切片进行免疫组织学的染色。具体而言，首先，将生殖腺的组织切片浸泡在各含有200倍稀释的小鼠抗Ddx4/MVH多克隆抗体(abcam公司制)以及200倍稀释的兔抗Foxo3a多克隆抗体(Cell Signaling Technology公司制)的溶液中，在4℃过夜进行一次抗体抗原反应。接着，去除各种一级抗体溶液，以PBS洗净后，将生殖腺的组织切片浸泡在各含有500倍稀释的Alexa Fluor 647标记的抗小鼠IgG抗体的溶液(分子探针、莱富生命科技公司制)以及含有500倍稀释的Alexa Fluor Plus 555标记的抗兔IgG抗体的溶液中，在室温进行二级抗原抗体反应3小时。接着，去除各种二级抗体溶液，以PBS洗净后，将生殖腺的组织切片进一步使用4′，6-二脒基-2-苯基吲哚(4′，6-diamidino-2-phenyl-indole，DAPI)(和光纯药工业公司制)染色。

(5)观察

在共聚焦显微镜(卡尔·蔡司公司制，型号Zeiss LSM 700)下观察通过(4)免疫染色的生殖腺的组织切片。在加压条件下培养的生殖腺的代表性结果如图2所示。在图2中，a～c为将受精后12.5日龄的雌性小鼠的生殖腺在加压条件下培养，且从开始培养的第21日采集生殖腺切片的免疫染色图。放大倍率为63倍。a为使用针对生殖细胞标记的MVH的抗体的免疫染色图。b为使用针对转录因子Foxo3a的抗体的免疫染色图。c为将通过DAPI的细胞核染色图叠加在a以及b的免疫染色图上的图像。比例尺为10μm。

并且，在制作通过(2)培养的生殖腺的切片前，通过萤光立体显微镜(奥林巴斯公司制、型号SZX16)获得的影像如图3所示。在图3中，「控制组(Control)」为在常态状态下培养的生殖腺，「加压(Pressured)」为在加压条件下培养的生殖腺。比例尺为50μm。

由图3，在开始培养第21日，在常态状态下培养的生殖腺中，大部分的原始生殖细胞分化为成长的二级卵泡。相较于此，在加压条件下培养的生殖腺中，明显存在未达20μm的小卵泡。

以此种小卵泡制作组织切片，并通过免疫染色详细探讨的结果，确认卵泡周围受一层扁平状的颗粒细胞包围，且转录因子Foxo3a局部存在于卵子的细胞核内(参照图2的a～c)。

由此可见，在加压条件下，原始生殖细胞受诱导分化为原始卵泡。

(6)蛋白质分解酵素(CTK)处理试验

接着，尝试对出生后7.5日龄的雌性小鼠的生殖腺在人为加压条件下进行蛋白质分解酵素(CTK)处理。

(6-1)蛋白质分解酵素(CTK)处理

具体而言，首先，将出生后7.5日龄的雌性小鼠的生殖腺置于6孔培养盘上的各孔，添加0.5mL的PBS(含有CTK)，培养1小时。再者，CTK的组成为，1μM CaCl2、0.1mg/mL胶原蛋白酶IV(Collagenase IV)、20％KSR(英杰生命技术)、0.025％胰蛋白酶EDTA(Trypsin EDTA)(英杰生命技术)。人为加压为，使用STREX公司的AGP-3001S(注册商标)施加33.33kPa的静水压。并且，作为对照，制备在不合CTK的PBS中未施加人为加压条件下培养1小时的生殖腺，以及在含有CTK的PBS中未施加人为加压条件下培养1小时的生殖腺。

(6-2)制作组织切片

将通过(6-1)以CTK处理的生殖腺，使用与参考例1的(1)相同的方法，制作生殖腺的组织切片。

(6-3)免疫染色

接着，将通过(3)获得的生殖腺的组织切片进行免疫组织学的染色。

(6-4)观察

在共聚焦显微镜(卡尔·蔡司公司制，型号Zeiss LSM 700)下观察通过(6-3)免疫染色的生殖腺的组织切片。结果如图4A所示。在图4A中，「PBS」为在不合CTK的PBS中未施加人为加压条件下培养1小时的生殖腺。「CTK」为在含有CTK的PBS中未施加人为加压条件下培养1小时的生殖腺。「CTK(P)」为在含有CTK的PBS中以人为加压条件下培养1小时的生殖腺。a、e以及i为使用针对在生殖细胞标记Stella的表现调控下表现的CFP的抗体的免疫染色图。b、f以及j为使用针对转录因子Foxo3a的抗体的免疫染色图。c、g以及k为使用针对生殖细胞标记的MVH的抗体的免疫染色图。d为将通过DAPI的细胞核染色图叠加在a～c的染色图上的图像。h为将通过DAPI的细胞核染色图叠加在e～g的染色图上的图像。l为将通过DAPI的细胞核染色图叠加在i～k的染色图上的图像。比例尺为10μm。

并且，图4B为通过图4A中使用针对转录因子Foxo3a的抗体的免疫染色图，计算出在细胞核内局部存在转录因子Foxo3a的卵母细胞的比例，并加以图像化。

由图4A以及图4B，显示出生后7.5日龄的雌性小鼠的生殖腺通过蛋白质分解酵素(CTK)处理后细胞外基质分解、原始卵泡卵子的Foxo3a移动到细胞核外、以及卵泡受诱导而成熟。进一步地显示，通过在人为加压条件下进行相同的蛋白质分解酵素处理，可以抑制所述Foxo3a移动到细胞核外。

由此可见，在生物体中，原始卵泡的维持与物理性压力有关。

[实施例2]将原始生殖细胞在低氧气浓度条件下进行体外培养

接着，尝试在体外培养系统中，在低氧气条件下培养受精后12.5日龄的胚胎生殖腺。

(1)制备生殖腺以及培养基

使用与实施例1的(1)相同的方法，制备生殖腺以及培养基。

(2)生殖腺的体外培养

除了以低氧气浓度条件下培养替代人工加压条件以外，使用与实施例1的(2)相同的方法，进行生殖腺的体外培养。再者，作为低氧气浓度条件，使用Astec公司制的APM30D，在5％氧气浓度下进行培养。并且，作为对照，也制备不进行低氧气浓度条件的相同培养物。

(3)制作组织切片

将通过(2)培养的生殖腺，使用与参考例1的(1)相同的方法，制作生殖腺的组织切片。

(4)免疫染色

接着，将通过(3)获得的生殖腺的组织切片，使用与实施例1的(4)相同的方法，进行免疫染色。

(5)观察

在共聚焦显微镜(卡尔·蔡司公司制，型号Zeiss LSM 700)下观察通过(4)免疫染色的生殖腺的组织切片。在低氧气浓度条件下培养的生殖腺的代表性结果如图5所示。在图5中，a～c为将受精后12.5日龄的雌性小鼠的生殖腺在低氧气浓度条件下培养，且从开始培养的第21日采集生殖腺切片的免疫染色图。放大倍率为63倍。a为使用针对生殖细胞标记的MVH的抗体的免疫染色图。b为使用针对转录因子Foxo3a的抗体的免疫染色图。c为将通过DAPI的细胞核染色图叠加在a以及b的免疫染色图上的图像。比例尺为10μm。

在开始培养的第21日，在一般氧气浓度条件下培养的生殖腺中，大部分的原始生殖细胞分化为成长的二级卵泡(图中未示出)。相较于此，在低氧气浓度条件下培养的生殖腺中，明显存在未达20μm的小卵泡。以此种小卵泡制作组织切片，并通过免疫染色详细探讨的结果，确认卵泡周围受一层扁平状的颗粒细胞包围，且转录因子Foxo3a局部存在于卵子的细胞核内(参照图5的a～c)。

由此可见，在低氧气浓度条件下，原始生殖细胞受诱导分化为原始卵泡。

[参考例2]将原始生殖细胞在PI3K抑制剂存在下进行体外培养

接着，尝试在体外培养系统中，通过在PI3K抑制剂存在下培养受精后12.5日龄的胚胎生殖腺，以确认其影响。

(1)制备生殖腺以及培养基

使用与实施例1的(1)相同的方法，制备生殖腺以及培养基。

(2)生殖腺的体外培养

首先，在6孔培养盘的各孔中，设置Transwell-COL薄膜(孔径3.0μm、直径24mm)(康宁公司制)，将通过(1)采集的生殖腺承载于薄膜上。接着，对各孔添加1.3mL的培养基，培养16日。并且，培养基为，通过αM2培养4日，再以S10培养。并且，从开始培养的第6日至第16日期间，在培养基中添加最终浓度为25μM的PI3K抑制剂的LY2914002(以下也会简称为「Ly」)(Cell Signaling Technology公司制、型号9901)。并且，从开始培养的第5日至第9日期间，在培养基中添加最终浓度为500nM的雌性激素受体拮抗剂的ICI 182，780(7α，17β-[9-[(4，4，5，5，5-五氟戊基)亚硫酰基]壬基]雌甾-1，3，5(10)-三烯-3，17-二醇)(7α，17β-[9-[(4，4，5，5，5-pentafluoropentyl)sulfinyl]nonyl]estra-1，3，5(10)-triene-3，17-diol)(Tocris Bioscience公司制)。再者，每隔1日更换约一半份量的新培养基。并且，作为对照，也制备不添加Ly的相同培养物(常态状态下的培养物)。

(3)观察

通过萤光立体显微镜(奥林巴斯公司制、型号SZX16)观察自开始培养起算第16日的生殖腺。结果如图6A所示。在图6A中，「控制组(Control)」为在常态状态(不存在Ly)下培养的生殖腺，「Ly」为在PI3K抑制剂的LY294002存在下培养的生殖腺。比例尺为50μm。

并且，图6B为在图6A中通过Stella-CFP的表现作为指标，计算卵母细胞的个数，并计算出未达20μm、20μm以上50μm以下、以及超过50μm的卵母细胞比例的图表。

由图6A，在开始培养第16日，在常态状态下(不存在Ly)培养的生殖腺中，大部分的原始生殖细胞分化为成长的二级卵泡。相较于此，在Ly存在下培养的生殖腺中，明显存在未达20μm的小卵泡。

由图6B，在常态状态下(不存在Ly)培养的生殖腺中，在全部卵母细胞中，尺寸未达20μm的卵母细胞的比例约为5％、尺寸在20μm以上50μm以下的卵母细胞的比例约为15％、尺寸超过50μm的卵母细胞的比例约为80％，具有大量尺寸超过50μm的卵母细胞。相较于此，在Ly存在下培养的生殖腺中，在全部卵母细胞中，尺寸未达20μm的卵母细胞的比例约为29％、尺寸在20μm以上50μm以下的卵母细胞的比例约为48％、尺寸超过50μm的卵母细胞的比例约为23％，与常态状态下相比，确认具有大量小卵泡。

[实施例3]将原始生殖细胞在加压条件下以及PI3K抑制剂存在下进行体外培养

接着，尝试在体外培养系统中，在人为加压条件下以及PI3K抑制剂存在下培养12.5日龄的雌性小鼠生殖腺。

(1)制备生殖腺以及培养基

使用与实施例1的(1)相同的方法，制备生殖腺以及培养基。

(2)生殖腺的体外培养

接着，使用通过(1)制备的培养基，在人为加压条件以及PI3K抑制剂存在下培养从12.5日龄的雌性小鼠采集的生殖腺。

具体而言，首先，在6孔培养盘的各孔中，设置Transwell-COL薄膜(孔径3.0μm、直径24mm)(康宁公司制)，将通过(1)采集的生殖腺承载于薄膜上。接着，对各孔添加1.3mL的培养基，培养16日。人为加压为，在开始培养的第6日至第16日期间，使用STREX公司的AGP-3001S(注册商标)施加33.33kPa的静水压。并且，在开始培养的第6日至第16日期间，在培养基中添加最终浓度为25μM的Ly。并且，培养基为，通过αM2培养4日，再以S10培养。并且，从开始培养的第5日至第9日期间，在培养基中添加最终浓度为500nM的雌性激素受体拮抗剂的ICI 182，780(7α，17β-[9-[(4，4，5，5，5-五氟戊基)亚硫酰基]壬基]雌甾-1，3，5(10)-三烯-3，17-二醇)(7α，17β-[9-[(4，4，5，5，5-pentafluoropentyl)sulfinyl]nonyl]estra-1，3，5(10)-triene-3，17-diol)(Tocris Bioscience公司制)。再者，每隔1日更换约一半份量的新培养基。并且，作为对照，也制备在Ly存在下且未加压的相同培养物。

(3)制作组织切片

将通过(2)培养的生殖腺，使用与参考例1的(1)相同的方法，制作生殖腺的组织切片。

(4)免疫染色

接着，将通过(3)获得的生殖腺的组织切片，使用与实施例1的(4)相同的方法，进行免疫组织学的染色。

(5)观察

在共聚焦显微镜(卡尔·蔡司公司制，型号Zeiss LSM 700)下观察通过(4)免疫染色的生殖腺的组织切片。结果如图7所示。在图7中，「无加压(No Press)(0kPa)」为在Ly存在下且未加压下培养的生殖腺。「加压(Press)(33.3kPa)」为在人为加压条件下且Ly存在下培养的生殖腺。a以及e为使用针对在生殖细胞标记Stella的表现调控下表现的CFP的抗体的免疫染色图。b以及f为使用针对转录因子Foxo3a的抗体的免疫染色图。c以及g为使用针对生殖细胞标记的MVH的抗体的免疫染色图。d为将通过DAPI的细胞核染色图叠加在a～c的染色图上的图像。h为将通过DAPI的细胞核染色图叠加在e～g的染色图上的图像。比例尺为10μm。

并且，图8A为通过图7中使用针对转录因子Foxo3a的抗体的免疫染色图，计算出在细胞核内局部存在转录因子Foxo3a的卵母细胞的比例，并加以图像化。图8B为通过图7中使用针对转录因子Foxo3a的抗体的免疫染色图，计算出在细胞质基质局部存在转录因子Foxo3a的卵母细胞的比例，并加以图像化。

由图7，在Ly存在下且未加压下培养的生殖腺中，虽然卵母细胞周围受一层扁平状的颗粒细胞包围，但是转录因子Foxo3a不仅局部存在于卵子的细胞核内，也局部存在于细胞质基质。相较于此，在人为加压条件下以及Ly存在下培养的生殖腺中，确认卵母细胞周围受一层扁平状的颗粒细胞包围，且转录因子Foxo3a局部存在于卵子的细胞核内。

由图8A以及图8B，在Ly存在下且未加压下培养的生殖腺中，在细胞核内局部存在转录因子Foxo3a的卵母细胞的比例约为52％，在细胞质基质局部存在转录因子Foxo3a的卵母细胞的比例约为48％。相较于此，在人为加压条件下以及Ly存在下培养的生殖腺中，在细胞核内局部存在转录因子Foxo3a的卵母细胞的比例约为82％，在细胞质基质局部存在转录因子Foxo3a的卵母细胞的比例约为18％，显示Foxo3a到细胞核外的移动受到抑制。

[实施例4]将原始生殖细胞在加压条件以及低氧气浓度条件下进行体外培养

接着，尝试在体外培养系统中，在人为加压条件以及低氧气浓度条件下培养受精后12.5日龄的胚胎生殖腺。

(1)制备生殖腺以及培养基

使用与实施例1的(1)相同的方法，制备生殖腺以及培养基。

(2)生殖腺的体外培养

除了在人为加压条件下以及低氧气浓度条件下培养以外，使用与实施例1的(2)相同的方法，进行生殖腺的体外培养。人为加压为，使用STREX公司的AGP-3001S(注册商标)施加33.33kPa的静水压。并且，作为低氧气浓度条件，使用Astec公司制的APM30D，在5％氧气浓度下进行培养。并且，作为对照，也制备了(1)出生后3.5日龄的卵巢、(2)人为加压条件下的相同培养物、(3)低氧气浓度条件下的相同培养物。

(3)流式细胞术

压碎通过(2)培养的生殖腺，制备细胞悬浮液。接着，使用流式细胞仪(型号：BDFACSAria III(648282B5)、BD Bioscience公司制)分析。结果如图9所示。上半段为显示细胞大小的前散射光(FSC)与在生殖细胞标记Stella的表现调控下表现的CFP的萤光之间的二维直方图。下半段为显示在CFP表现细胞中FSC分布的直方图。下半段的左侧的「合并(Merge)」为叠加下半段的4个直方图。

在进行流式细胞术前通过萤光立体显微镜(奥林巴斯公司制、型号SZX16)观察各生殖腺，结果显示，在人为加压条件下以及低氧气浓度条件下，也与在人为加压条件下或低氧气浓度条件下相同，原始生殖细胞受诱导分化为原始卵泡(图中未示出)。

并且，由图9，在人为加压条件下或低氧气浓度条件下培养的生殖腺中，可以获得与出生后3.5日龄的卵巢相同大小程度的卵母细胞，相较于此，在人为加压条件下以及低氧气浓度条件下培养的生殖腺中，尺寸较小的卵母细胞的比例有增加的倾向。

综上所述，显示本实施例的方法可以再现生物体生殖腺内的环境，使原始生殖细胞分化为原始卵泡。

【产业上的利用可能性】

根据本实施例的方法，可以在体外将原始生殖细胞分化为原始卵泡。通过使用本实施例的方法获得的原始卵泡，举例而言，适用于治疗不孕、经济动物的有效育种、濒危动物的繁殖、探究不孕原因以及解析停经病症的机制等。