伊氏锥虫HGPRT基因cDNA的克隆及其在E.coli中的表达

摘要

根据引物设计的一般原则,参照伊氏锥虫HGPRT基因的核苷酸序列设计、合成一对引物,PCR扩增伊氏锥虫HGPRT基因cDNA.低熔点琼脂糖回收PCR产物,并将其克隆至pGEM-T Easy载体中,经酶切、PCR鉴定和序列分析,获得重组中间质粒pGEM/HGPRT.重组中间质粒pGEM/HGPRT经Nco Ⅰ和SalⅠ双酶切,回收目的片段HGPRT,以非融合形式插入原核表达质粒pBV220构建表达质粒pBV/HGPRT,转化大肠杆菌DH5a,42℃诱导表达,聚丙烯酰胺凝胶电泳和薄层扫描分析,表达产物HGPRT的分子量约为23 kD,与理论推算值相符,表达率占总菌体蛋白的19%,经间接ELISA检测,表达产物能被伊氏锥虫阳性血清所识别.