RNAi抑制PrP表达载体的构建及其在PrP功能研究中的初步应用

摘要

本文旨在构建有效抑制朊蛋白(Prion protein,PrP)表达的重组质粒,并以此为工具控制PrP表达,从而探讨PrP对细胞SOD活性的影响.设计并化学合成1对含有发夹结构的寡核苷酸片段(shPrP),退火后与表达载体pG-super(Hairpin siRNA expressing vector)定向连接,构建重组质粒 pG-super-shPrP.对重组子进行PCR鉴定,测序正确后,脂质体法转染C6细胞,采用实时荧光定量RT-PCR检测PrP mRNA的表达水平,以验证 pC-super-shPrP的抑制效率;结果表明:重组质粒 pG-super-shPrP 构建成功,且显著降低C6细胞PrP mRNA表达(P<0.05),抑制效率为 34.2%.利用 pG-super、pG-super-shPrP 分别转染C6细胞,并检测细胞SOD总活性及SOD表达水平,探讨PrP对细胞SOD活性的影响及其作用机制,结果表明PrP促进细胞SOD的活性(P<0.01),但对细胞SOD的表达量无影响,即PrP对SOD活性的促进作用与SOD1的表达量无关.本研究在成功构建了PrP的RNA 干扰表达质粒的基础上,利用此质粒,在细胞水平上揭示了PrP对细胞SOD活性的促进作用.