实时荧光定量PCR对瘤胃纤维分解菌定量方法的构建

摘要

试验构建了白色瘤胃球菌、黄色瘤胃球菌及产琥珀酸丝状杆菌等3种瘤胃纤维分解菌实时荧光绝对定量PCR的标准品及标准曲线,以用于纤维分解菌的定量测定.提取瘤胃微生物总DNA.以各菌特异性引物进行PCR扩增,回收纯化PCK产物,与pMD18-T Vector连接并转化到大肠杆菌.用氨苄青霉素培养基筛选阳性重组质粒,提取含目的片段质粒DNA,通过PCR及测序鉴定重组质粒.根据OD值确定浓度.将梯度稀释的质粒作为模板,进行荧光定量PCR反应做出标准曲线.结果表明:所构建的3条标准曲线具有很高的相关性(R2>0.999),并获得了高扩增效率产物(白色瘤胃球菌为101%、黄色瘤胃球菌为98.0%、产琥珀酸丝状杆菌为97.7%),说明成功构建了瘤胃纤维分解菌实时绝对定量PCR的标准品和标准曲线,为定量研究瘤胃纤维分解菌奠定基础.