表达弓形虫TgGRA4重组腺病毒载体的构建及鉴定

摘要

本研究通过构建表达弓形虫致密颗粒抗原4(TgGRA4)蛋白的重组腺病毒vAd5-TgGAR4,并在HEK293细胞内包装病毒后进行蛋白表达,为弓形虫病疫苗研发提供研究基础。采用PCR方法扩增弓形虫TgGRA4基因,将其连接到pCR259穿梭载体上,构建重组穿梭载体pCR259-TgGRA4;之后转化到含有腺病毒载体Transpose-Ad^(TM)294的HighQ-1 Transpose-Ad^(TM)294感受态细胞中,通过同源重组获得重组腺病毒载体294-TgGRA4;载体质粒经PacⅠ酶切线性化后转染至HEK293细胞,包装重组腺病毒vAd5-TgGRA4,TCID;方法测定病毒滴度。经PCR鉴定和测序,获得TgGRA4基因,与参考序列(M76432)同源性为100%,经EcoRⅠ、XbaⅠ双酶切鉴定、蛋白质印迹和IFA检测,表明重组穿梭载体pCR259-TgGRA4构建成功,并能表达TgGRA4蛋白,经NdeⅠ酶切鉴定,表明重组腺病毒载体294-TgGRA4构建成功,IFA检测包装的重组腺病毒vAd5-TgGRA4能表达TgGRA4蛋白,初代重组腺病毒滴度为2.85×10^(8)IU/mL。当感染复数(MOI)=10,病毒滴度可以提高到4.34×10^(8)IU/mL。本研究构建了含有弓形虫TgGRA4基因的重组腺病毒载体294-TgGRA4,制备了高滴度的vAd5-TgGRA4并能表达目的蛋白。