甲型肝炎病毒细胞膜蛋白受体2促进小鼠巨噬细胞内毒素耐受形成的研究

摘要

目的寻找内毒素耐受(ET)的潜在关键基因,为脓毒症的治疗提供理论和实验依据。方法①实验1(基因芯片与生物信息分析):从基因表达数据库(GEO)中下载ET相关基因数据集GSE47783,该数据集由脂多糖(LPS)刺激小鼠巨噬细胞建立脓毒症模型(LPS组)和ET模型(ET组)后进行实验获得;利用IDEP 0.92软件筛选数据集中两组差异表达基因(DEG),同时进行基因本体(GO)分析,并定位DEG主要富集的功能和信号通路。利用基因与蛋白质相互作用检索数据库(STRING),针对DEG构建蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)网络,筛选出核心基因甲型肝炎病毒细胞膜蛋白受体2(HAVCR2)进行后续验证研究。②实验2(小鼠巨噬细胞株RAW264.7模型制备):体外培养RAW264.7细胞,通过LPS刺激制备ET模型(ET组,用10μg/L的LPS培养24 h后,再用100μg/L的LPS培养4 h)和脓毒症模型(LPS组,用100μg/L的LPS培养4 h);磷酸盐缓冲液(PBS)组给予等体积溶媒PBS培养4 h。采用实时荧光定量聚合酶链反应(RT-qPCR)和蛋白质免疫印迹试验(Western blotting)检测细胞HAVCR2的mRNA及蛋白表达。③实验3(HAVCR2慢病毒载体转染RAW264.7细胞):为进一步明确HAVCR2是否参与ET形成,用慢病毒短发夹RNA(shRNA)技术敲低RAW264.7细胞中的HAVCR2后,再制备ET模型(HAVCR2--ET组),并设非敲低HAVCR2的对照组(ET组)。采用RT-qPCR法检测细胞中巨噬细胞极化关键基因〔精氨酸酶1(ARG1)、CD206、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-1β(IL-1β)、一氧化氮合酶2(NOS2)〕的mRNA表达。结果①实验1:共获得1013个DEG;与LPS组比较,ET组有521个上调基因,492个下调基因;这些DEG的功能主要为增加生物合成、抑制炎症反应,主要富集于Janus激酶/信号转导与转录激活因子(JAK/STAT)、NOD样受体、Toll样受体(TLR)、TNF、缺氧诱导因子-1(HIF-1)等信号通路。选择ET组第一个表达上调的膜蛋白HAVCR2作为验证研究的目标。②实验2:体外实验结果显示,经大剂量LPS处理后,RAW264.7细胞中HAVCR2 mRNA表达较PBS组明显下调;而ET组HAVCR2 mRNA表达明显高于LPS组(2^(-ΔΔCT):1.10±0.10比0.60±0.10,P<0.05);Western blotting检测结果与RT-qPCR结果一致。③实验3:与ET组相比,HAVCR2--ET组细胞ARG1和CD206的mRMA表达明显降低〔ARG1 mRNA(2^(-ΔΔCT)):0.50±0.10比1.00±0.10,CD206 mRNA(2^(-ΔΔCT)):0.73±0.10比1.00±0.10〕,下游因子TNF-α和IL-1β的mRNA表达明显升高〔TNF-αmRNA(2^(-ΔΔCT)):2.20±0.10比1.00±0.10,IL-1βmRNA(2^(-ΔΔCT)):9.00±0.10比1.00±0.10〕,差异均有统计学意义(均P<0.05);两组NOS2 mRNA表达差异无统计学意义。结论HAVCR2参与脓毒症下游炎性因子的调节,参与ET的形成,有望成为脓毒症新的治疗靶点。