miR-150调控TIM-3在小鼠巨噬细胞内毒素耐受中的作用机制研究

摘要

第一部分：TIM-3在小鼠巨噬细胞内毒素耐受时的表达 目的：筛选小鼠巨噬细胞在内毒素耐受时的差异基因，检测内毒素耐受时TIM-3的表达情况。方法：通过在基因芯片数据库 GEO中选择小鼠巨噬细胞内毒素耐受数据集：GSE47783；通过在线分析软件GEO2R筛选差异基因；DAVID进行基因功能注释分析；采用LPS处理小鼠巨噬细胞系RAW264.7构建内毒素耐受模型与脓毒血症组，ELISA检测 TNF-α在上清液中含量，选择内毒素耐受组中高表达 TIM-3进行RT-qPCR、WB、IF检测验证。结果：在小鼠内毒素耐受数据集GSE47783中共筛选出差异基因1219个，内毒素耐受上调基因684个，下调基因535个（纠正P<0.01），其中TIM-3在内毒素耐受组中显著增高（P<0.01）;通过DAVID发现差异基因富集到：JAK-STAT、TLR、MAPK、等信号通路。内毒素耐受组上清液 TNF-α降低约1/3,差异有统计学显著性（P<0.01）;与内毒素组相比，内毒素耐受组TIM-3在2、4、6、8h时表达增加，并在4h时到达高峰；与内毒素组相比，4h时内毒素耐受组TIM-3的mRNA表达增加（P＜0.05）；TIM-3位于巨噬细胞膜表面。结论：内毒素耐受时，TIM-3 mRNA、蛋白表达增高。膜蛋白TIM-3可能在内毒素耐受的产生机制中可能具有重要作用。 第二部分：基于通过生物信息学方法探讨 TIM-3在内毒素耐受中的作用机制研究 目的：探讨 TIM-3在内毒素耐受中的作用机制。方法：通过慢病毒载体构建 TIM-3干扰载体，并设置阴性对照组；建立稳定表达巨噬细胞株：TIM-3 KD组与TIM-3阴性组。通过GEO网站找到TIM-3敲低后的miRNAs的芯片数据GSE76839,再通过GCBI在线软件预测出靶基因并根据靶基因进行信号通路富集分析。WB验证敲低细胞株的效果；RT-qPCR验证所筛选的信号通路关键基因、巨噬细胞极化相关基因以及效应因子TNF-α、IL-1β的mRNA水平。结果：TIM-3慢病毒干扰载体构建成功后并建立了稳定表达细胞株（TIM-3 KD组与TIM-3阴性组）。通过GCBI共筛选出上调miRNAs13条、下调miRNAs13条（P<0.01）；通过TargetScan及 miRanda在线软件共预测出靶基因1774条；主要富集到MAPK、WNT、HIPPO等多条信号通路。在4h时与阴性组比较， MAPK、WNT、HIPPO信号通路关键基因在TIM-3 KD组表达增高（P＜0.05）；在内毒素耐受4h时与阴性组比较，TIM-3 KD组中炎症因子TNF-α、IL-1β表达增高（P＜0.05）；M2相关基因ARG1、CD206表达降低（P＜0.05）；M1型相关基因NOS2表达未见差异。结论：TIM-3通过相关miRNAs调控MAPK、WNT、HIPPO等信号通路，促进巨噬细胞向M2型转化，并减少炎症因子TNF-α、IL-1β表达，促进巨噬细胞内毒素耐受形成。 第三部分：miR-150调控TIM-3在内毒素耐受中的机制研究 目的：探索 TIM-3的 miRNAs转录后调控机制，筛选直接作用于TIM-3的miRNA。方法：通过miRNA.org与Targetscan7.1预测出可能的miRNAs；通过LPS构建小鼠巨噬细胞脓毒血症与内毒素耐受模型，通过RT-qPCR检测两组中的目标miRNAs与TIM-3的表达量；根据初步筛选的 miRNA构建 miR-150的模拟物 mimics，并设置阴性对照组；mimics通过脂质体2000法转染小鼠巨噬细胞系，再次通过 RT-qPCR检测TIM-3的mRNA水平；双荧光素酶报告实验验证miR-150与TIM-3的直接转录后调控关系。结果：通过生物信息学方法共预测出miR-150/212/34a等15个miRNAs；通过RT-qPCR检测发现miR-150与TIM-3在各组中呈现负性相关性；于阴性对照 mimics相比，miR-150的mimics在转染细胞后导致靶基因TIM-3的mRNA水平降低；双荧光素酶报告实验证实：miR-150与TIM-3有直接作用关系。结论：内毒素耐受中miR-150通过转录后调控直接抑制TIM-3的mRNA水平。

目录

声明

英汉缩略语名词对照

前言

第一部分 TIM-3在小鼠巨噬细胞内毒素耐受时的表达研究

1 材料和方法

2 结果

3 讨论

第二部分 基于通过生物信息学方法探讨TIM-3在内毒素耐受中的作用机制研究

1 材料和方法

2 结果

3 讨论

第三部分 miR-150调控TIM-3在内毒素耐受中的机制研究

1 材料和方法

2 结果

3 讨论

参考文献

综述：内毒素耐受的研究进展

致谢

读博期间的发表的论文：