雷帕霉素诱导自噬对脓毒症急性肾损伤的保护作用

摘要

目的探讨自噬诱导剂雷帕霉素对脓毒症急性肾损伤（AKI）的保护作用。方法将24只雄性SD大鼠按随机数字表法分为假手术（Sham）组、盲肠结扎穿孔术（CLP）模型组和雷帕霉素干预组（Rap干预组）,每组8只。采用CLP建立脓毒症AKI大鼠模型;Sham组仅分离盲肠但不进行盲肠结扎穿刺。Rap干预组于制模后立即腹腔注射1.6 mg雷帕霉素;CLP模型组注射等量生理盐水。各组于制模24 h取外周血后处死大鼠,检测血尿素氮（BUN）、血肌酐（SCr）水平;过碘酸雪夫染色（PAS染色）后光镜下观察肾组织病理形态学改变;通过实时聚合酶链反应（real-time PCR,RT-PCR）检测肾小管自噬相关基因Atg-5、Beclin-1的mRNA表达;蛋白质免疫印迹试验（Western Blot）检测肾小管自噬体膜标志蛋白微管相关蛋白1轻链3-Ⅱ（LC3-Ⅱ）、Beclin-1及凋亡相关蛋白细胞色素C（Cyt C）、Bax、Bcl-2的表达;原位末端缺刻标记法（TUNEL）检测肾小管上皮细胞凋亡。结果雷帕霉素可有效抑制脓毒症AKI大鼠肾组织病理学改变,降低BUN、SCr水平。CLP模型组肾小管Atg-5、Beclin-1、LC3-Ⅱ表达均较Sham组明显升高[Atg-5mRNA(2△△Ct):2.34±0.04比1.00±0.03,Beclin-1 mRNA(2△△Ct):1.40±0.02比1.00±0.03,LC3-Ⅱ蛋白（灰度值）:0.82±0.03比0.45±0.04,Beclin-1蛋白（灰度值）:0.59±0.06比0.29±0.03,均P＜0.01],雷帕霉素可进一步上调Atg-5、Beclin-1、LC3-Ⅱ表达[Atg-5 mRNA(2△△Ct):3.28±0.19比2.34±0.04,Beclin-1 mRNA(2△△Ct):2.38±0.08比1.40±0.02,LC3-Ⅱ蛋白（灰度值）:1.11±0.07比0.82±0.03,Beclin-1蛋白（灰度值）:0.85±0.05比0.59±0.06,均P＜0.01]。与Sham组比较,CLP模型组凋亡的肾小管上皮细胞显著增多[（34.49±10.45）%比（2.78±1.40）%,P＜0.01],Cyt C、Bax蛋白表达明显升高（灰度值:0.87±0.02比0.46±0.03,1.20±0.06比0.46±0.01,均P＜0.01）,Bcl-2表达明显降低（灰度值:0.64±0.02比1.33±0.09,P＜0.01）;雷帕霉素可有效拮抗细胞凋亡[（15.44±5.50）%比（34.49±10.45）%,P＜0.01],并抑制Cyt C、Bax蛋白表达（灰度值:0.72±0.03比0.87±0.02,0.84±0.03比1.20±0.06,均P＜0.01）,上调Bcl-2蛋白表达（灰度值:0.77±0.04比0.64±0.02,P＜0.01）。结论雷帕霉素可通过诱导和促进细胞自噬,从而拮抗肾小管组织细胞凋亡来发挥对脓毒症AKI的保护作用。