利用常间回文重复序列丛集及相关蛋白9系统敲除小鼠肾集合管上皮细胞系的水通道蛋白2基因

摘要

目的利用常间回文重复序列丛集(CRISPR)/CRISPR相关蛋白9(Cas9)系统敲除小鼠肾内髓集合管3(m-IMCD3)上皮细胞的水通道蛋白2(Aqp2)基因。方法在小鼠Aqp2基因的第1、4个外显子上各设计两个小向导RNA(sgRNA),分别为sgRNA1-1、sgRNA1-2、sgRNA4-1、sgRNA4-2,并将其成功克隆进常间回文重复序列丛集慢病毒载体2上。将测序正确的质粒转染到m-IMCD3细胞中,提取各单克隆细胞系的基因组DNA,通过聚合酶链反应扩增出sgRNA作用靶点的DNA片段并测序。利用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)及免疫荧光检测Aqp2的表达。结果成功构建出含有相应sgRNA的载体;4个sgRNA对Aqp2基因的靶点都有切割作用;sgRNA1-1与sgRNA4-2组合能成功把两者间5500bp的DNA片段敲除;应用RT-PCR及免疫荧光证实应用CRISPR/Cas9系统敲除Aqp2后,该m-IMCD3细胞系中的Aqp2mRNA及蛋白几乎未见表达。结论通过CRISPR/Cas9系统可获得Aqp2基因敲除的肾集合管上皮细胞系。