一种结肠癌干细胞上皮-间质转化分层模型的建立和验证

摘要

背景与目的:肿瘤干细胞(cancer stem cells,CSC)是肿瘤中具有干细胞特性的一类细胞,同时具有自我更新能力及多向分化潜能.CSC在肿瘤转移过程中起着重要作用.上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)与恶性肿瘤浸润、转移及与肿瘤患者预后紧密联系.本研究以CSC是否经EMT为标准,建立一种新型结肠癌干细胞EMT分层模型,以评价不同活性物质对不同分型的结肠癌干细胞表型的影响.并用当下研究成熟的抑癌基因miR-139-5p及其靶向抑制的转录因子4(transcription factor 4,TCF4)蛋白验证上述模型的可行性,为临床研究提供理论依据.方法:以CD44和细胞上皮黏附分子/上皮特异性抗原(epithelial cell adhesion molecule/epithelial specific antigen,EpCAM/ESA)为结肠癌干细胞标志物,采用流式细胞术分选皮下移植瘤中CD44+ESA+、CD44+ESA-细胞亚群和转移瘤中CD44+ESA+、CD44+ESA-细胞亚群,分别命名为Epi-S、Epi-P、pEMT-S和pEMT-P,亲本细胞株HCT116作为后续实验的阴性对照;验证分选后不同细胞亚群的多药耐药性、克隆形成能力以及干性转录因子SOX2、OCT4和EMT相关蛋白E-cadherin、N-cadherin、vimentin的表达情况;检测miR-139-5p过表达、TCF4敲低对Epi-P和pEMT-P以及TCF4过表达对Epi-S和pEMT-S CSC侵袭能力与EMT标志分子E-cadherin、N-cadherin和vimentin蛋白的影响.结果:相较于HCT116亲本细胞株,Epi-S、Epi-P、pEMT-S和pEMT-P共4种CSC分型均对奥沙利铂(oxaliplatin,LOHP)和氟尿嘧啶(fluorouracil,5-FU)产生了不同程度的抗性;干性相关转录因子OCT4和SOX2在4种CSC分型中表达均升高,与亲本细胞株相比,差异有统计学意义(P<0.05);上皮相关标志物E-cadherin、N-cadherin和vimentin在4种CSC分型中表达均升高,与亲本细胞株相比,差异有统计学意义(P<0.05);过表达miR-139-5p或敲低TCF4均能抑制Epi-P和pEMT-P结肠癌干细胞亚型的侵袭能力(P<0.01);在表型稳定未经历EMT的上皮亚系Epi-S中,过表达TCF4能够显著促进其侵袭能力(P<0.01);Epi-P和pEMT-P中过表达miR-139-5p和敲低TCF4,上皮标志物E-cadherin表达增加,间充质标志物N-cadherin和vimentin表达下降.结论:以CD44和ESA为结肠癌干细胞标志物分选出的4种分型具有不同表型可塑性,该模型可用来评价不同生物活性物质对结肠癌干细胞上皮-间质转化的影响.