鞘氨醇激酶1干扰慢病毒载体及干扰慢病毒的构建

摘要

目的 构建人鞘氨醇激酶1（SPK1）干扰慢病毒载体,并制备SPK1干扰慢病毒.方法 将1 ～5号pLKO.2-shSPK1质粒及pLKO.1-Scramble-RFP对照质粒转染人胚肾293（HEK293）细胞,实时定量聚合酶链反应（qRT-PCR）检测pLKO.2-shSPK1质粒对SPK1的干扰效率,筛选干扰效果最好的pLKO.2-shSPK1质粒;将所筛选质粒中以SPK1为靶点的短发夹结构RNA（SPK1-shRNA）插入pLKO.1-Scramble-GFP质粒中,获得表达shRNA-SPK1的pLKO.1-shSPK1-GFP重组质粒;将该质粒进行测序及酶切鉴定后,转染HEK293细胞48 h后荧光显微镜及流式细胞仪观察绿色荧光强度,qRT-PCR检测其对SPK1的干扰效率.将pLKO.1-shSPK1-GFP重组质粒进行慢病毒包装及滴度检测.结果 与pLKO.1-Scramble-RFP对照质粒比较,转染1～5号pLKO.2-shSPK1质粒的HEK293细胞中SPK1 mRNA水平均有一定程度降低,其中3号pLKO.2-shSPK1质粒干扰效果最好,选取其进行pLKO.1-shSPK1-GFP重组质粒构建,经测序及酶切检验,证明重组质粒构建成功.pLKO.1-shSPK1-GFP重组质粒转染HEK293细胞后,绿色荧光阳性率达94.4％,SPK1 mRNA水平明显下降（P＜0.01）,干扰率达51.0％.进行慢病毒包装后测得病毒滴度为6×10^8 pfu/ml.结论 本研究成功构建了人SPK1干扰慢病毒载体,并制备了SPK1干扰慢病毒.