用 cre-loxp 鼠研究 Runx2在釉质发育中的作用

摘要

目的：为研究 Runx2基因缺失对牙釉质发育的影响，拟建立 Runx2基因条件性敲除的小鼠动物模型。方法利用染色体位点特异性重组酶 cre-loxp 系统和 FLP-frt 的条件性基因打靶，借助于同源重组将两个同向的 loxp 位点置于 Runx2基因的编码重要功能域外显子2两侧的内含子序列中，从而获得表型正常的 Flox 小鼠，为了提高 ES 细胞筛选的效率，插入被 FRT 位点瞄定的、作为选择性筛选的阳性标记 neo 基因，同时插入作为负性筛选的 DTA，通过电转的方式，将构建成功的载体电导入到 ES 细胞，并通过对中靶的 ES 细胞进行筛选和鉴定，得到了同源重组正确的阳性克隆，通过显微注射，将中靶的 ES 细胞导入囊胚中，将囊胚移植到代孕鼠子宫内，最终得到嵌合体小鼠，将此嵌合体小鼠与 FLP 工具鼠杂交，利用 FRT与 FLP 特异性识别，去掉 neo 基因即可获得阳性的 loxp 鼠，将其与组织特异性表达 cre 重组酶的转基因小鼠杂交，特异性表达的 cre 重组酶将介导 loxp 位点间的基因片段重组。小鼠出生后经 PCR 鉴别，获得 Runx2基因条件性敲除的杂合子小鼠，条件性敲除的杂合子小鼠自交或与 loxp 纯合子小鼠杂交，小鼠出生后，PCR 鉴别筛选条件性完全敲除的小鼠。RT-PCR 法检测外源性 Cre 基因的表达。结果构建了 cre 鼠、loxp 鼠和 Runx2基因条件性敲除的小鼠模型。结论利用染色体位点特异性重组酶 loxp-cre 系统和 FLP-frt 系统可以很好的研究 Runx2基因缺失对牙釉质发育的影响。