EPCR基因mRNA在人胃癌细胞系中的表达及其shRNA干扰载体内源性筛靶研究

摘要

目的 检测人胃癌细胞株中内皮细胞蛋白C受体(endothelial protein creceptor,EPCR)基因的mRNA表达水平,构建EPCR基因特异的短发夹RNA(shRNA)干扰载体,并通过内源性筛靶实验检测EPCR mRNA表达,筛选出最佳的干扰靶序列.方法 通过逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)及蛋白免疫印迹(Westernblot)检测胃癌细胞系(SGC7901、MGC803、HGC27、AGS)中EPCR mRNA和蛋白的表达,筛选出EPCR高表达的细胞株;设计5对EPCR基因特异性短发夹RNA(shRNA)干扰片段pGPH1/GFP/Neo-EPCR,用Lipofec-tamine 2000将pGPH1/GFP/Neo-EPCR转染入EPCR高表达的人胃癌细胞,以pGPH1/GFP/Neo空载体作对照;转染后通过观察绿色荧光蛋白来判断转染的效率,选出最优质粒/脂质体比;转染后收集样本,采用RT-PCR及Western blot进行检测,筛选出有效的干扰片段.结果 EPCR在MGC803细胞中表达量最高;最佳质粒:脂质体比值为1μg:1μL;pGPH 1/GFP/Neo-EPCR-homo-555为最有效的干扰质粒.结论 成功筛选出针对EPCR基因特异的shRNA干扰载体,转染细胞后可下调EPCR的表达,为进一步研究EPCR的功能和肿瘤的基因治疗奠定了基础.