RNR3启动子调控的红绿荧光蛋白双信号发光酵母细胞对化学诱变原的筛选

摘要

目的:构建RNR3启动子调控的红绿荧光蛋白双信号发光酵母细胞,用于快速筛选化学诱变原。方法:用PCR方法YIPlac204TC-NLS-DsRed-Express-2扩增DsRed-Express-2红色荧光蛋白,将其插入到pGPD载体,构建成GPD启动子驱动的红色荧光蛋白酵母报告载体(pGPD-DsRed-Express2),用醋酸锂方法将其转化于RNR3启动子调控的绿色荧光蛋白(yEGFP)发光酵母细胞(W303-1A/RNR3-yEGFP),从而构建成红、绿荧光蛋白双信发光酵母细胞。红色荧光蛋白(DsRed-Express-2)信号可用于校正细胞数和状态不同对yEGFP发光的影响。用不同诱变原分别作用于该发光酵母细胞,于第0、4、8、12、16和20小时,用黑色96孔酶标板分别测红、绿荧光蛋白的发光强度,用相对荧光强度(yEGFP/DsRed-Express2)描述诱变原的剂量效应关系。结果:在与DNA发生结合的化合物中,放线菌素D和溴乙锭均呈阴性;在与DNA发生烷基化的化合物中,甲磺酸甲脂(MMS)和瘤可宁呈阳性结果,而丝裂霉素C呈阴性结果;在使DNA发生断裂的诱变原中,顺铂、博来霉素和福来霉素呈阴性,而4-硝基-N-氧化喹啉(4-NQO)呈阳性结果;在抑制DNA合成酶或拓扑异构酶的诱变原中,5-氟尿嘧啶呈阳性结果,而羟基脲、喜树碱和阿非迪霉素均呈阴性结果;非基因毒性化合物秋水仙碱、刀豆氨酸和四环素均呈阴性。结论:该重组发光酵母细胞(W303-1A/yEGFP/DsRed-Express2)可作为传统致突变评价方法的补充,具有快速、方便和高通量特点。