响应面研究化学物对RAD54启动子调控的红绿双信号发光酵母细胞的联合基因毒性

摘要

随着工农业社会的发展，各种化学物通过各种途径排入环境中，通过大气循环、水循环和食物链等方式进入人体。但是，当前关于致突变的安全性评价的相关研究课题大多是聚焦于对单一化合物的评价，如何评价两种或两种以上化学物致突变效果，目前研究少。不可回避的问题是在自然环境中是多种污染物共存的，各化学物在生物体内彼此影响，作用方式复杂，产生多种联合作用效应。本研究通过建立一种双信号重组酵母细胞模型，借助响应面分析法对有关实验参数进行回归拟合，结合响应面曲线和等高线的描述分析，可直观的得出各化学诱变原的交互作用结果。
　　1.RAD54启动子的选择
　　将2种不同长度RAD54启动子调控的yEGFP报告载体(pR1558-yEGFP，pR406-yEGFP)分别转入W303-1A酵母细胞中，构建成2种启动子调控的发光酵母细胞，分别命名为W303-1A/R1558-yEGFP和W303-1A/R406-yEGFP。用不同化学诱变原作用后，用流式细胞仪和多功能发光仪测酵母的发光强度，结果发现2种启动子调控的酵母细胞发光强度均与化学诱变原（甲磺酸甲脂、4-硝基-N氧化喹啉和5-氟尿嘧啶）有明显的剂量效应关系，但是W303-1A/R1558-yEGFP剂量效应关系较为明显，产生的最大诱导倍数(5.96、2.19和2.71)明显高于W303-1A/R406-yEGFP所产生的最大诱导倍数(2.53、1.79和1.91)，同时发现流式细胞仪测定效果明显优于发光仪。所以用RAD54全启动子调控重组发光酵母细胞进行联合基因毒性研究。
　　2.RAD54全启动区调控的双信号发光酵母细胞的构建
　　由于细胞的发光除与诱变原的诱导有关外，还受细胞数量和细胞“状态”的影响，利用DsRed-Express2(红色荧光蛋白)作为第二信号，建立R1558启动子调控的红、绿荧光蛋白基因发光酵母细胞。当化学诱变原作用于该重组酵母细胞时，yEGFP/DsRed-Express2（相对发光度）与化学诱变原间具有明显的剂量效应关系。
　　3.响应面联合致突变分析方法的建立
　　(1)首先对化学诱变原进行单因素基因毒性研究
　　首先用化学诱变原对重组基因双信号发光酵母细胞进行单因素实验研究，用多功能发光分析仪分别测yEGFP和DsRed-Express2的发光强度，求其相对发光度。参照Ames实验判断的标准，即受试物作用于重组细胞后产生的相对发光度为对照1.5倍以上，并具有明显的剂量效应关系，则判断为阳性。根据剂量效应关系确定各化学诱变原作用闽浓度。
　　(2)选用MMS、瘤可宁和顺铂进行联合基因毒性研究发现，三者交互作用参数(β123，P=0.011)有统计学意义，说明化学物间存在交互作用。进一步分析发现MMS与瘤可宁(β12，P=0.113)、瘤可宁和顺铂(β23，P=0.613)无统计学意义，而MMS和顺铂(β13，P＜0.005)交互作用明显。再通过响应面等高线图分析可以看出MMS和顺铂之间不呈线性关系，随着浓度的升高曲线先呈弓弧线向内，再呈现弓弧线向外的趋势，说明两者之间在低浓度时有拮抗作用，高浓度时表现出协同作用。
　　(3)选用5-氟尿嘧啶、喜树碱和羟基脲进行联合基因毒性研究发现，三者交互作用参数(β123，P＜0.001)有统计学意义，说明三者之间存在交互作用。经过进一步分析发现5-氟尿嘧啶与喜树碱(β12，P=0.008)、5-氟尿嘧啶与羟基脲(β13，P=0.006)、喜树碱与羟基脲(β23，P=0.006)，两两间存在不同程度的交互作用。从响应面曲线等高线图中可以看出喜树碱和5-Fu之间不呈线性关系，随着浓度的升高曲线呈现弓弧线向外的趋势，可见两者之间表现出协同作用。

目录

摘要

符号说明

第一章 RAD54启动子的选择

1 材料与方法

1．1 材料

1．2 方法

2 结果

2．1 RAD54调控的yEGFP酵母报告载体

2．2 R1558启动子调控的重组yEGFP酵母细胞

2．3 R406启动子调控的重组yEGFP酵母细胞

2．4 化学诱变原对2种不同RAD54启动子调控的重组酵母细胞的评价结果

3．讨论

第二章 RAD54全启动子调控的双信号发光酵母细胞的建立

1．材料和方法

1．1 材料

1．2 方法

1．3 DsRed-Express-2在酵母细胞中的表达

2 结果

2．2 GPD驱动的DsRed-Express-2酵母报告载体

2．3 DsRed-Express-2在酵母细胞中的表达

2．4 荧光显微镜下观察

3．讨论

第三章 化学诱变原对RAD54启动子调控的双信号发光酵母细胞联合基因毒性的研究

1．1 材料

2．结果

2．1 单因素研究结果

2．2 MMS、瘤可宁和顺铂联合基因毒性研究结果

2．3 5-Fu、喜树碱和羟基脲联合基因毒性研究结果

3．讨论

参考文献

综述 响应面分析法在联合毒性中的应用

附录

致谢

攻读硕士学位期间发表的学术论文情况

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