Kod DNA聚合酶的制备及纯化研究

摘要

Kod DNA聚合酶作为常见的高保真DNA聚合酶,具有较强的DNA延伸能力以及3'-5'外切核酸酶校正活性。本研究通过对重组Kod DNA聚合酶分离纯化条件的优化,以期提高其表达和纯化效率以及片段扩增能力。利用异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(isopropylβ-D-thiogalactoside,IPTG)对pET-30a-Kod进行诱导表达后,利用酶溶法和超声波破碎法对细胞破碎并提取粗酶液,然后利用Ni-NTA柱洗脱纯化获得较纯Kod DNA酶,再经透析得到高纯度Kod DNA酶,利用PCR反应和Sanger测序手段来检测自提纯化的Kod DNA聚合酶活性及保真性。同时,本研究对IPTG浓度和洗脱液中咪唑浓度等重要参数进行优化。结果表明,在28℃条件下0.1 mmol/L IPTG诱导16-18 h后,Kod DNA聚合酶高效表达;当咪唑浓度为200 mmol/L时蛋白洗脱效果最佳。PCR反应体系中Mg^(2+)浓度为1.5 mmol/L,Kod DNA聚合酶浓度为0.06125μg/μL时,Kod DNA聚合酶效率较高,能有效地扩增3194 bp的目的条带;通过序列比对,PCR产物序列中未引入任何突变。经优化制备后的Kod DNA聚合酶在酶活性和扩增保真性上均能达到商用高保真DNA聚合酶水平。本研究为节省实验室PCR成本,进一步开发和利用Kod DNA聚合酶奠定一定的基础。