脆弱拟杆菌Pif1解旋酶的表达纯化与晶体生长

摘要

获得可用于X射线衍射的B.f Pif1单晶以用于探究B.f Pif1结构与功能.构建原核表达载体pET15b-SUMO-B.f Pif1,并进行B.f Pif1重组蛋白的诱导表达;经镍柱亲和层析、SUMO酶切、DEAE交换层析与S200凝胶过滤层析等一系列纯化;并利用Stopped-flow技术检测纯化蛋白的活性;使用结晶机器人及多种试剂盒进行结晶条件筛选与优化培养,并进行初步的X射线衍射分析.获得高纯度(>98.5％)与高浓度(17 mg/mL)的B.f Pif1蛋白,动力学结果显示其解旋活性良好.结晶实验表明:在0.1 mol/L Bis-Tris乙酸(pH 8.3),0.05 mol/L碳酸氢钠,5％甘油和0.015 mol/L亚精胺条件下培养出形态较好的单晶,其X射线衍射分辨率达到3.5?.成功表达纯化与结晶培养出具有较高分辨率的B.f Pif1蛋白的单晶.