预防和/或治疗与金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、化脓性链球菌、屎肠球菌、阴沟肠杆菌、奇异变形杆菌、脆弱拟杆菌、表皮葡萄球菌、痤疮丙酸杆菌、白色念珠菌和/或糠秕马拉色菌相关的感染、定植或疾病的方法

摘要

本发明的主题是对金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、化脓性链球菌、屎肠球菌、阴沟肠杆菌、奇异变形杆菌、脆弱拟杆菌、表皮葡萄球菌、痤疮丙酸杆菌、白色念珠菌和/或糠秕马拉色菌菌株具有拮抗活性的细菌或细菌混合物，以及其在治疗和/或预防与那些病原菌相关的感染或定植中的用途。本发明涉及意欲在皮肤、伤口、粘膜和附属器官上预防和/或治疗感染或定植的包含一种或多种非病原性拮抗菌株的护理产品。

说明书

技术领域

本发明涉及对病原性细菌或酵母具有拮抗活性的细菌(下文中 称为“拮抗细菌”)及其作为活性成分或在医疗设备中的用途，尤 其是在治疗和/或预防与这些病原性细菌或酵母相关的定植和/或感 染中的用途，所述病原性细菌或酵母属于以下属和种：金黄色葡萄 球菌(staphylococcusaureus)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、化脓性链球菌(Streptococcuspyogenes)、屎肠球菌 (Enterococcusfaecium)、阴沟肠杆菌(Enterobactercloacae)、奇异变 形杆菌(Proteusmirabilis)、脆弱拟杆菌(Bacteroidesfragilis)、表皮葡 萄球菌(staphylococcusepidermidis)、痤疮丙酸杆菌 (Propionibacteriumacnes)、白色念珠菌(Candidaalbicans)和/或糠秕 马拉色菌(Malasseziafurfur)。选择对病原性细菌或酵母具有拮抗性的 细菌是因为它们能够抑制病原性细菌或酵母的附着和发育和/或增 殖，从而稳定和/或调解生态系统。本发明涉及意欲用于预防或治疗 皮肤、伤口、粘膜和体表生长物上的感染或定植的包含一种或多种 非病原性拮抗菌株的护理产品。

背景技术

金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌造成某些病理病症，例如皮肤 和粘膜感染、伤口感染，尤其是慢性伤口感染(溃疡、糖尿病伤口)、 烧伤和手术伤口。这些细菌种类尤其因为造成延迟治愈而为人所知。 它们也涉及其他病理病症，例如胃肠道、尿路和肺部的感染、中耳 炎或鼻窦炎。

铜绿假单胞菌，或者称为绿脓杆菌，在某些情况下是病原性的。 这些非常耐药的细菌与其他革兰氏阴性菌一起正越来越经常地涉及 医院内感染。该菌株具有组织成生物膜的能力，这使其对抗生素更 加耐药。它是临床上最难治疗的细菌之一。在虚弱的(免疫抑制) 患者中死亡率达到50％。它是一种对多种杀菌剂非常耐药的广泛存 在的微生物，其经常在医院环境中，并导致实际医院菌株的出现(由 于其对抗生素的耐药性)。它产生各种形式的病理病症：眼部感染、 伤口感染(尤其烧伤和手术感染)、尿路感染(尤其在导尿管之后)、 胃肠道和肺部感染(例如在支气管镜检查之后)、接种脑膜炎、败 血症例如严重感染的最终状态或在经历免疫抑制治疗的患者、白血 病患者等中的并发症。它容易在免疫抑制(由于化疗或AIDS)的个 体、烧伤受害者和囊性纤维化受害者中引起系统性感染。

金黄色葡萄球菌是葡萄球菌属中最具有病原性的种类。它造成 食物中毒、化脓性局部感染、以及在某些极端情况下造成物理性败 血症(移植、心脏假体)。该种类被证明是在某些位置或在某些环 境下的条件致病菌。它是一种对天然纯化机制具有良好耐药性的广 泛存在的微生物。还在共生菌群中发现金黄色葡萄球菌(在15％-30％ 健康个体的鼻腔和喉咙，也可以在消化道中发现少量，经常在会阴 水平)。

金黄色葡萄球菌有致病能力，尤其是在有机体中繁殖和扩散的 侵袭能力，以及有毒的能力。金黄色葡萄球菌具有极大的用于开发 耐抗生素的突变体的能力(举例而言，可以提及医院内感染主要原 因之一的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌，或MRSA)。

这些病原性细菌和酵母具有在健康或免疫抑制的宿主中附着于 表面，尤其是上皮组织并以生物膜的形式发育的能力。生物膜定义 为附着于生物表面(活体组织、皮肤等)或非生物表面(惰性材料 如硅氧烷或钢)且被困在有机聚合物基质内的微生物(或微生物群 落)的复杂组装物(Costerton等，1999，Dunne，2002)。因此，这些 生物膜可以是单一特异性的，例如单一的细菌或酵母种类的化合物， 或当其由几种细菌或种类组成时，它是混合的。

通常治疗与病原性细菌种类存在有关的感染是使用抗生素(青 霉素、头孢菌素)。然而，使用这种方法存在一些缺点：

-这些抗生素通常具有相当大的作用谱，可能造成共生菌群的 不平衡，从而造成病原性微生物的定植；

-细菌能够获得耐这些抗生素的能力；

-生物膜形式的细菌耐药性与单独的细菌相比极大增强，也称 为浮游细胞。

面对病原性微生物对抗生素具有多种耐药性的问题，迫切需要 发现这种治疗的替代方案。

预期用以预防或治疗细菌或酵母来源感染的一种解决方案是使 用对病原性种类有拮抗性的细菌株。因此使用术语细菌疗法。这些 拮抗菌株能够通过其代谢产生抗菌分子和/或干扰病原性细菌和酵母 的附着和/或破坏病原性细菌和酵母之间的通讯和/或具有血管生成 活性。它们还能够控制炎症(免疫调控性能)。这些细菌在皮肤、 伤口、粘膜或体表生长物的表面形成能够暂时掌控并限制病原性细 菌和酵母着床的阳性生物膜。

当感染和/或定植位于皮肤上和/或伤口里时，这尤为有利。

这些拮抗性菌株通常属于乳酸菌家族。这些菌株从各种基质(主 要是粪便)中分离。这些菌株的活性被广泛用于预防和治疗肠粘膜 水平疾病，因此使用术语益生菌。在耳、鼻、喉粘膜以及泌尿生殖 道黏膜水平的其他应用也已经被描述。举例而言，可以提及涉及尿 片或卫生巾的EP871503，所述尿片或卫生巾包含具有拮抗性质的 选自弯曲乳杆菌(Lactobacilluscurvatus)、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)、乳酸乳球菌(Lactococcuslactis)的微生物，使其能够对抗 在所述吸收性物品中或在泌尿生殖区中存在或形成的不良微生物的 菌株。专利申请WO99/53932涉及用于治疗中耳炎的组合物，包含 选自血链球菌(Streptococcussanguis)、口腔链球菌(Streptococcus oralis)、和轻型链球菌(Streptococcusmitis)的微生物。

发明内容

本申请人特别关注对病原性菌株金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞 菌具有拮抗性的菌株。

本发明的一个潜在目的还在于在皮肤、体表生长物、粘膜和/或 伤口表面形成防止或限制致病菌着床及其增殖的暂时的阳性生物 膜。

根据本发明的拮抗细菌在用于涉及病原性种类金黄色葡萄球菌 和铜绿假单胞菌的病理病症中尤为有利，例如胃肠道、尿路和肺部 感染、中耳炎或鼻窦炎、伤口或涉及伤口、皮肤、体表生长物或黏 膜定植的病理病症。

根据本发明的拮抗细菌不仅在用于各种类型的伤口(慢性、急 性、烧伤)中尤为有利，而且在皮肤病症(例如，毛囊炎、脓疱疮、 湿疹、疡肿、炭疽病、甲沟炎、遗传性过敏症(atopies)、口角炎、 与病毒如疱疹病毒或水痘病毒有关的病变的重复感染)中也很有利。

实际上，伤口是外伤之后的病变，造成皮肤损失或皮肤裂开。 针对伤口的形成建立愈合过程。

伤口的自然愈合主要根据三个连续阶段发生，这些阶段的每一 个根据精确的时间顺序由带来修复过程进展的特异性细胞活动表 征：炎症阶段、肉芽阶段(或增殖阶段)、和疤痕形成阶段。

伤口愈合的速度和质量取决于受影响器官的总体病症、伤口的 病因、伤口的病症和位置、可能出现的感染，以及可能诱发愈合障 碍的遗传因素。撕裂或割开的皮肤不再作为对抗微生物的屏障，细 菌于是能渗入器官，造成感染。

细菌和酵母不可避免地存在于伤口中，这是自然定植。

根据细菌和/或酵母的量、存在的细菌和/或酵母的种类和器官的 反应，区分定植、局部感染和感染。

定植是在伤口内存在一定量的细菌和/或酵母而不引起炎症反 应。微生物在伤口繁殖并附着在表皮细胞上之后，在患者和其微生 物菌群之间建立了平衡。微生物保持并附着在伤口表面以形成生物 膜。从定量的角度看，定植的特征是微生物的量少于10⁵个细菌/mm³。 如果细菌和/或酵母的量超过了该数量，有些作者称为关键定植，则 严格来讲是在相当多细菌和/或酵母定植存在下的局部浅表感染。这 种相当多细菌和/或酵母的存在对愈合过程的正确运行是有害的，并 诱导延迟愈合。

当细菌和/或酵母微生物的存在导致局部炎症反应以及出现带有 反映由存在的微生物引起的组织侵袭的临床体征的一般体征(存在 大量微生物、细菌毒性、患者免疫防御机制的降低)时，将使用术 语“感染”。感染的特征是局部和一般临床体征。

所述感染能够导致伤口扩大，其中暴露基本的解剖结构如韧带 或骨。

细菌定植不需要特别的治疗方法，而感染需要建立局部和总体 的抗菌治疗。

在伤口的不愈合或延迟愈合中，感染通常直接或间接地是决定 性因素。伤口的任何细菌和/或酵母污染会增加炎症。

这在中度污染(在开放性伤口的情况中是不可避免的)的情况 下可能是有利的，但在造成延迟愈合的伤口感染的情况下是有害的。

因此，愈合的即刻并发症首先是感染，其阻止愈合过程的开始 使其不能建立；当伤口中存在的细菌和/或酵母的量妨碍了愈合过程 或使伤口恶化时，该伤口被认为是受到感染。

在这种情况下，愈合，称为二期愈合，通常需要使用皮肤病药 物和手术工具(手术刀、刮匙等)。例如，在腿溃疡的情况下，有 必要提前用杀菌剂(例如洗必泰或己脒定)消毒伤口并清理伤口， 这通过手术作用或使用蛋白药物，例如目的是破坏污染伤口的死皮 肤条的药物去除碎片和过量分泌物。在用于治疗伤口感染的常用的 活性剂中，可以提及银、铜、奥替尼淀、碘、PHMB(聚六亚甲基双 胍)和蜂蜜。

然而，在伤口中不建议抗菌剂和/或杀菌剂。这些活性剂的功效， 从其作用机制的角度看，是短期存在的，它们被有机物灭活，它们 可能对细胞成分有毒，它们是广谱的，因此，它们不仅攻击病原性 细菌，也会破坏共生菌群。而且，一定数量的细菌菌株已经对杀菌 剂/抗菌剂耐药。

因此，需要在治疗和/或预防细菌和/或酵母引起的伤口感染或定 植中有效的活性剂，所述活性剂高效、容易使用且非侵入性。

预期用以在皮肤、伤口、粘膜和/或体表生长物水平预防或治疗 细菌来源或由酵母引起的感染或定植的一种解决方案是使用对病原 性菌株有拮抗性的细菌株。这些菌株能够通过其代谢产生抗菌分子 和/或干扰病原性细菌和/或酵母的附着。这些细菌还能够在皮肤、伤 口、粘膜或体表生长物的表面短暂形成限制病原性细菌和/或酵母着 床的阳性生物膜。

这些拮抗性菌株通常属于乳酸菌家族和/或已经从人粘膜的共生 菌群中分离。这些菌株的活性被广泛用于预防和治疗肠粘膜、ENT 粘膜和阴道粘膜水平的疾病。WO96/38159、WO00/61201、EP1140 226、EP1461012和WO2006/013441描述了所述菌株。

这些菌株的拮抗作用归因于各种机制，例如：

-含碳和/或含氮基质的营养竞争；

-产生抗菌分子，如乳酸、过氧化氢(H₂O₂)、还原分子或细菌 素；

-在粘膜上对结合位点的附着竞争；

-产生生物表面活性剂；

-抑制或破坏各种细菌种类之间的细胞通讯；

-能够刺激局部和系统免疫的免疫调控活性。

在皮肤和伤口上使用益生菌菌株的应用也通常利用之前描述的 活性之一。

因此，可以提及关于益生菌菌株嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)ATCC4356和ATCC43121和多发酵芽孢杆菌(Bacillus polyfermenticus)在皮肤和肠粘膜水平的拮抗作用的应用((Halper等， 2003，Im等，2009)。长双歧杆菌(Bifidobacteriumlongum)reuter、副 干酪乳杆菌(Lactobacillusparacasei)CNCMI-2116、胚芽乳酸杆菌 (Lactobacillusjohnsonii)La1和透明颤菌(Vitreoscillafiliformis)的益 生菌菌株也已经以局部形式被用于调节皮肤水平的炎症现象和失调 ((Gueniche等，2006，Gueniche等，2008a，Gueniche等，2008b， Gueniche等，2008c，Gueniche等，2008d，Gueniche等，2009，Gueniche 等，2010)。在本申请上下文中，作者强调菌株的免疫调控能力。专 利申请EP1593382和WO2006/037922描述了这种菌株。

植物乳杆菌菌株ATCC10241已经被描述为通过释放破坏细胞 通讯(或群体感应)的信号分子用于限制铜绿假单胞菌的生长和生 物膜的形成。在大鼠的烧伤模型或人的烧伤上直接应用一块浸有该 菌株培养物的纱布已经能够证实其功效((Peral等，2009，Valdez等， 2005)。该菌株对中性粒细胞和白细胞的免疫调控能力也已经被开 发用于治疗慢性伤口(糖尿病伤口、各种溃疡)和减少由铜绿假单 胞菌引起的炎症((Peral等，2010，Ramos等，2010，Ramos等，2012)。 Brachkova等(Brachkova等，2011)已经描述了该菌株的海藻酸盐膜制 剂用于预防由铜绿假单胞菌引起的烧伤感染。

发酵乳杆菌(Lactobacillusfermentum)菌株RC-14显示在手术移 植体水平抑制金黄色葡萄球菌的附着并限制并该微生物有关的感染 的显著能力(Gan等，2002)。这种抗菌效果归因于释放生物表面活性 剂。

H.Sikorska等，2013的研究还证实了分离自不同来源的乳酸杆 菌和双歧杆菌的几个菌株在预防和治疗耐甲氧西林的金黄色葡萄球 菌的功效。

已经证实了罗伊氏乳杆菌(Lactobacillusreuteri)菌株(KCTC 3594、KCTC3678和KCTC3679)对表皮葡萄球菌和痤疮丙酸杆菌生 长的抑制(Kang等，2012)。

已经证实了乳酸菌属HY449产生的细菌素对皮肤炎性细菌，如 表皮葡萄球菌ATCC12228、金黄色葡萄球菌ATCC65389、化脓性 链球菌ATCC21059和痤疮丙酸杆菌ATCC6919的效果(Ho等， 2006)。

已经描述了需要使用益生菌菌株(凝结芽孢杆菌属(Bacillus coagulans)的乳酸菌)的敷料或织物(US7025974和WO 2008/074331)。这些制剂的功效仅仅是基于利用能够产生乳酸作为 基本广谱抗菌剂的细菌菌株。

本发明的目的是提供基于细菌的新型活性剂，其对病原性细菌 金黄色葡萄球菌和/或铜绿假单胞菌具有拮抗作用，能有效治疗和/ 或预防与这些病原性细菌有关的定植和/或感染，尤其是在皮肤、伤 口、粘膜和体表生长物水平上。此外，这些活性剂可施用与皮肤、 伤口、粘膜和体表生长物直接接触，或能够容易地加入组合物中， 尤其适合局部应用且非侵入性的组合物。

以创新的方式，基于几个标准预选拮抗细菌：(i)它们抑制病 原性微生物，即金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌生长的能力，(ii) 它们在胶原蛋白和表皮上附着并形成阳性生物膜的能力，(iii)它 们限制病原性微生物在包含胶原蛋白的基质上附着的能力，和(iv) 它们限制炎症反应(巨噬细胞引起的TNF-α生产)的能力。

这些细菌能够在皮肤、伤口、粘膜和体表生长物水平上形成屏 障作用，从而预防并限制定植和感染的风险。

本发明人尤其有兴趣选择主要对金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞 菌具有拮抗性的菌株，所述金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌是涉及 感染，尤其是医院内感染的主要病原性种类。

此外，除了抑制金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌的菌株外，本 发明人已经选择了抑制其他病原性种类，如化脓性链球菌、屎肠球 菌、阴沟肠杆菌、奇异变形杆菌、脆弱拟杆菌、表皮葡萄球菌、痤 疮丙酸杆菌、白色念珠菌和糠秕马拉色菌发育的细菌菌株。

痤疮丙酸杆菌是厌氧革兰氏阳性杆菌，其生长相对缓慢，通常 存在于皮肤、毛发和粘膜。它会造成痤疮。

该细菌广泛存在于大多数健康成人的皮肤菌群中，但它也会造 成术后感染，这尤其在移植体存在的情况下可能是严重的：中枢神 经系统感染、眼内炎、心内膜炎、ENT和肺球感染、椎间盘炎、腹 膜炎和骨关节感染。

表皮葡萄球菌是在几乎100％的人皮肤上的共生菌；其脂解性质 使其能在皮脂中繁衍。它通常是无害的，但它在免疫系统受损的患 者或具有导管或假肢的患者中会造成真实感染。这些可能是皮肤感 染和鼻感染，例如鼻窦炎或女性中的泌尿系感染，男性中较少。这 些细菌具有产生生物膜的能力，使其能附着于医学假体的表面。

白色念珠菌本身根据其位置有不同表现。在免疫活性患者(即， 其防御系统是有效的，与免疫抑制患者不同)中，它的表现形式是 口腔中的鹅口疮、皮肤红肿和瘙痒，尤其是在有利于酵母发育的温 暖潮湿区域的褶皱内，以及小的局部生殖器炎症，例如人的尿道炎 或女性中带白色分泌物和瘙痒的外阴阴道炎。

糠秕马拉色菌是主要涉及作为一种常见的炎性皮肤病(在 3％-5％的人群中观察到)的脂溢性皮炎的酵母。它以由脂肪和黄色 鳞片覆盖的红色斑块的形式存在，或多或少发痒，主要在富含皮脂 腺的区域，脂溢性区中。在脸上，病变的位置是暗示性的：鼻和唇 之间的沟、眉毛根部、头皮、鼻翼、羽片褶皱、外耳、外耳道。在 头皮上，经常性参与导致或多或少的脂溢性头皮屑病症。在躯干上， 注意人的两个普通区：胸骨和两个肩胛之间的区域。

在成人和婴儿(小于3个月)中均有遇到，其在婴儿中通过头 皮内传统的“摇篮帽”和臀部的红斑体现。在成人中，该病理病症 尤其在20-40岁的受试者中观察到。男性比女性更频繁地感染。在女 性中，尤其在更年期观察到其发展。多因素炎症来源的病理病症不 具传染性，其能够通过最常由压力或污染以及缺少阳光引发的侵袭 发展。

病因未知，但认为是一种微观真菌在可能产生特殊免疫过敏的 病症中起作用。

花斑癣是一种浅部真菌病，与糠秕马拉色菌在皮肤上的繁殖有 关。该酵母通常生存在皮肤表面，但在某些情况下，它以极快的速 度增殖并造成这些小的褐色或变色的标记。

该真菌尤其嗜好油性皮肤，存在于胸，但也存在于颈和肩膀、 上背部和上肢、几乎不存在于下肢。

因此，本发明的一个目的是选自以下的细菌：在本申请中也称 为F3C5p的Lactobacillussaniviri菌株(以保藏号CNCMI-4650于 2012年7月12日保藏于法国国家培养物和微生物保藏中心， [NationalCollectionofMicroorganismCultures]，InstitutPasteur，25 rueduDocteurRoux，75724ParisCedex15，France，后文称为 “CNCM”)、在本申请中也称为F50C2p、F52C3p和F41C3p的唾 液乳杆菌(Lactobacillussalivarius)(分别以保藏号CNCMI-4651、 CNCMI-4652和CNCMI-4653于2012年7月12日保藏于CNCM)、 在本申请中也称为F3C2v的轻型链球菌(以保藏号CNCMI-4654于 2012年7月12日保藏于CNCM)，和在本申请中也称为L1C1的戊 糖乳杆菌(Lactobacilluspentosus)或植物乳杆菌(以保藏号CNCM I-4655于2012年7月12日保藏于CNCM)。这些细菌在本申请中 被称为“根据本发明的细菌”。

本发明的一个目的也是根据本发明的细菌用作免疫调节剂。

本发明的一个目的也是这种细菌作为活性成分或作为医疗设备 或作为化妆品或作为食品增补剂的用途。根据本发明的细菌还可以 用作药物、医疗设备、化妆品或食品增补剂中的活性成分。

本发明还要求保护根据本发明的细菌用于治疗和/或预防与至少 一种选自金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、化脓性链球菌、屎肠球 菌、阴沟肠杆菌、奇异变形杆菌、脆弱拟杆菌、表皮葡萄球菌、痤 疮丙酸杆菌、白色念珠菌和糠秕马拉色菌的细菌或酵母有关的定植 和/或感染。

优选地，本发明涉及根据本发明的细菌用于治疗和/或预防与金 黄色葡萄球菌和/或铜绿假单胞菌有关的定植和/或感染。

更具体地，本发明涉及治疗和/或预防由病原性细菌或酵母引起 的伤口和皮肤定植和/或感染。

术语“治疗(treatment)”或“治疗(treating)”感染或定植是指减 少和/或抑制这种感染或定植的发展。

术语“预防(prevention)”或“预防(preventing)”感染或定植是指 减少和/或避免感染或定植症状的出现。

表述“伤口的感染或定植”意欲指选自以下的感染或定植：糖 尿病足溃疡、动脉源性腿部溃疡、静脉源性腿部溃疡、褥疮、甲沟 炎、与急性伤口有关的感染、与外伤伤口有关的感染，例如由切断 引起的伤口、穿透性伤口、由热或碱剂和烧伤引起的伤口；与术后 伤口有关的感染，例如手术切口的单纯缝合伤口、皮肤切除后的复 杂缝合伤口、需要二期愈合的手术磨皮和非缝合性伤口。

根据本发明的细菌可以加入组合物，例如医疗设备中。为了本 发明的目的，术语“医疗设备”意欲指假体、导管、敷料、造瘘袋、 手术用帷帘、导尿管、气管导管、鼓膜造孔插管、绷带、支持绷带、 整形和乳房植入物、隐形眼镜、宫内避孕器、或用于缝线的其他材 料。

本发明的一个目的还是包含至少一种根据本发明的细菌的组合 物。所述组合物在可接受的介质中包含至少一种根据本发明的细菌。 术语“可接受的介质”意欲指与皮肤、伤口、粘膜和体表生长物相 容的介质。

根据本发明的组合物，或根据本发明的细菌，可以局部、口服 或肠胃外施用。

优选地，这种组合物或这种细菌适合局部应用于皮肤、伤口、 体表生长物或粘膜，例如鼻和喉、尿道、消化道或呼吸道粘膜。因 此，所述组合物可直接应用于皮肤、伤口或粘膜。

术语“局部应用”意欲指应用于皮肤、伤口、粘膜和/或体表生 长物。

根据本发明的组合物优选包含10³-10²个细菌，优选10⁶-10¹¹个。

所述局部组合物可以是液体、糊剂或固体形式，更具体地是药 膏、霜剂、乳液、软膏、粉末、浸渍垫、合成洗涤剂、抹布、溶液、 凝胶、喷雾剂、泡沫、悬浮液、洗液、口红、洗发水或洗涤碱的形 式。它也可以是微球或纳米球的悬浮液或脂质或聚合物囊泡或微胶 囊或聚合物贴剂和控制释放的水凝胶的形式。局部应用的这种组合 物可以是无水形式、含水形式或乳液形式。

胃肠外组合物可以是用于皮下注射的溶液(可注射溶液)的形 式。

口服组合物可以是溶液、粉末、凝胶胶囊或片剂的形式、或可 以加入食品中，例如乳制品中。

根据本发明的细菌可以以灭活细胞，尤其是由热、UV照射或任 何其他方法灭活的灭活细胞的形式加入所述组合物。它还可以以包 封或非包封、固定或非固定、冻干或非冻干的活细胞的形式或细胞 提取物的形式加入。它还可以是细胞裂解物或本领域技术人员已知 的任何其他呈现形式。

优选地，本发明全文中所用的拮抗细菌或包含它们的盖仑制剂， 将会以局部应用组合物的形式，或加入作为敷料组合物一部分的合 成或非合成基质的形式直接应用于伤口。

在该实施方案中，将细菌配制成敷料、或配制成其本身被包含 于敷料中或在应用敷料时被包含的组合物。因此，根据本发明的敷 料包含至少一种根据本发明的细菌，或者少一种根据本发明的组合 物。

根据本发明的拮抗细菌或包含它们的根据本发明的组合物可以 加入敷料结构的任何成分，条件是所述细菌能直接或间接与伤口表 面接触。

优选且为了促进快速作用，将细菌(或包含它的根据本发明的 组合物)加入与伤口接触的敷料层，或沉积在与伤口接触的敷料表 面。

因此，有利地，细菌(或包含它的根据本发明的组合物)以连 续或非连续的方式沉积于意欲与伤口接触的表面：

-以液体形式，例如喷雾包含它的溶液或悬浮液；

-或以固体形式，例如筛分包含它的粉末。

为了本发明的目的，术语“敷料”意欲指用于治疗伤口的各种 类型的敷料。通常，敷料包含至少一个粘性或非粘性层或基质。

与伤口接触的层或表面可以由在敷料领域通常为此目的而使用 的任何材料或材料组合构成。在这些材料中，可以提及吸收性泡沫， 尤其是基于聚氨酯的亲水性泡沫；纺织材料，尤其是基于吸收性或 超吸收性纤维的无纺布；水凝胶；或这些材料的组合；吸收性或非 吸收性添加剂材料；粘附性或非粘附性的界面结构。

通常，可以调整敷料的盖伦制剂或结构以根据需要获得快速或 延迟的细菌的特定释放谱。

因此，可以将细菌(或包含它的根据本发明的组合物)加入任 何现有敷料类型，例如但不限于这些实例：

-海藻酸盐，例如，举例而言，由LaboratoiresUrgo以商品名 销售的产品，或由以商品名销售的 产品；

-水合细胞产品，例如，举例而言，由LaboratoiresUrgo以商品 名Urgotul销售的产品，或由Systagenix以商品名Tielle销 售的产品；

-亲水胶体敷料，例如，举例而言，由LaboratoiresUrgo以商品 名销售的产品，和由Coloplast以商品名销售 的产品；

-水凝胶，例如，举例而言，由LaboratoiresUrgo以商品名Urgo 销售的产品，和由Smith&Nephew以商品名Intrasite销售的产品；

-水性敷料，例如，举例而言，由LaboratoiresUrgo以商品名Urgo Crevasses销售的产品，或由3M以商品名销售的产品。

当然，在盖伦制剂或敷料中使用的一种或多种细菌的量可以根 据所需动力学以及与其性质、溶解度、耐热性等有关的特定约束条 件进行调节。

在敷料成分中使用时，根据本发明的一种或多种细菌以使细菌 释放至伤口渗出液的量为0.001g/l-50g/l，优选0.01-10g/l的量加入。

根据所选的盖伦制剂，敷料的使用可能需要预先浸渍或用溶液 例如生理盐水使敷料水化以激活拮抗细菌。

根据本发明的组合物包含一种或多种拮抗菌株，任选地与至少 一种选自益生菌、益生元和酵母的化合物组合。在益生元中，可以 以实例的方式提及果聚糖例如菊糖、低聚果糖或反式低聚半乳糖、 或其他长链或支链的糖。

根据本发明的细菌还可以与活性剂组合，尤其是选自抗真菌剂、 止痛药、抗炎药、促愈合剂、保湿剂、角质溶解剂、重组活性剂和 麻醉剂的活性剂。

具体地，可以引入根据本发明的组合物的活性剂选自：

-抗真菌剂，例如多烯类、制霉菌素、两性霉素B、纳他霉素、 咪唑类化合物(咪康唑、酮康唑、克霉唑、益康唑、联苯苄唑、硝 酸布康唑、芬替康唑、异康唑、奥昔康唑、舍他康唑、硫康唑、噻 苯咪唑、噻康唑)、三唑类化合物(氟康唑、伊曲康唑、雷夫康唑、 泊沙康唑、伏立康唑)、烯丙胺、特比萘芬、阿莫罗芬、萘替芬、 或布替那芬；

-氟胞嘧啶(抗代谢物)、灰黄霉素、卡泊芬净和米卡芬净；

-止痛药，例如对乙酰氨基酚、可待因、右丙氧芬、曲马多、吗 啡及其衍生物、皮质激素及其衍生物；

-抗炎药，例如糖皮质激素、非甾体类抗炎药、阿司匹林、布洛 芬、酮洛芬、氟比洛芬、醋氯芬酸、双氯芬酸、酮咯酸、美洛昔康、 吡罗昔康、替诺昔康、氧萘丙酸、吲哚美辛、萘普生、尼美舒利、 塞来考昔、依托考昔、帕瑞考昔、罗非考昔、伐地考昔、保泰松、 尼氟灭酸或甲芬那酸；

-促进愈合的活性剂，例如视黄醇、维生素A、维生素E、N-乙 酰羟脯氨酸、积雪草(Centellaasiatica)提取物、木瓜蛋白酶、硅氧烷、 百里香、绿花白千层、迷迭香和鼠尾草精油、透明质酸、具有1-4 个单糖单元的合成多硫酸寡糖，例如蔗糖八硫酸钾、蔗糖八硫酸银 盐或硫糖铝、或尿囊素；

-保湿剂，例如透明质酸、尿素、甘油、脂肪酸、水通道蛋白调 节剂、植物油、壳聚糖、某些糖，包括山梨醇、黄油和蜡；

-角质溶解剂，例如水杨酸、水杨酸锌、抗坏血酸、α-羟基酸(乙 醇酸、乳酸、苹果酸、柠檬酸、酒石酸)、银枫、酸樱桃或罗望子 提取物、尿素、局部维甲酸(Sederma)、通过发酵枯草芽 孢杆菌(Bacillussubtilis)获得的蛋白酶、或产品(SACI CFPA)；

-重组活性剂(例如用于体表生长物的重组活性剂)，例如二氧 化硅衍生物、维生素E、甘菊、钙、马尾草提取物或silklipester；

-麻醉剂，例如苯坐卡因、利多卡因、地布卡因、盐酸普拉莫星、 布比卡因、甲哌卡因、普鲁卡因、或依替卡因。

通过说明的方式而没有任何限制的性质，将给出根据本发明的 细菌的用途的各种实例，从而可以说明根据本发明的拮抗菌株的抗 菌活性。

附图说明

图1代表根据本发明的细菌与病原菌接触并在琼脂培养基上孵 育48小时后观察到的抑菌圈。

图2代表加入敷料的根据本发明的细菌与病原菌接触并在琼脂 培养基上孵育48小时后形成的抑菌圈。

图3代表根据本发明的细菌附着于重组表皮上的能力(以附着 细菌的量CFU/cm²表示)。

图4代表根据本发明的细菌相对于金黄色葡萄球菌在胶原蛋白 表面上的附着竞争试验结果(孵育24小时之后附着的金黄色葡萄球 菌的量(CFU/cm²))。

图5代表根据本发明的细菌相对于金黄色葡萄球菌在胶原蛋白 表面上的排除试验结果(孵育24小时之后的金黄色葡萄球菌的量 (CFU/cm²))。

图6代表根据本发明的细菌相对于铜绿假单胞菌在胶原蛋白表 面上的附着竞争试验结果(孵育24小时之后附着的铜绿假单胞菌的 量(CFU/cm²))。

图7代表根据本发明的细菌相对于铜绿假单胞菌在胶原蛋白表 面上的排除试验结果(孵育24小时之后的铜绿假单胞菌的量 (CFU/cm²))。

图8a和8b代表巨噬细胞与根据本发明的细菌接触3.5小时之 后，存在或不存在来自大肠杆菌(E.coli)O127：B8的LPS的刺激下释 放的TNF-α的量(pg/ml)。

具体实施方式

实施例1：细菌株LactobacillussaniviriF3C5p(CNCMI-4650)、唾液乳杆菌F50C2p(CNCMI-4651)、唾液乳杆菌F52C3p(CNCMI-4652)、唾液乳杆菌F41C3p(CNCMI-4653)、轻型链球菌F3C2v(CNCMI-4654)和戊糖乳杆菌或植物乳杆菌L1C1(CNCMI-4655)的抗菌活性

在ManRogosaSharpe(MRS)培养基中于37℃和厌氧条件下培养 LactobacillussaniviriF3C5p(CNCMI-4650)、唾液乳杆菌F50C2p (CNCMI-4651)、唾液乳杆菌F52C3p(CNCMI-4652)、唾液乳 杆菌F41C3p(CNCMI-4653)、轻型链球菌F3C2v(CNCMI-4654) 和戊糖乳杆菌或植物乳杆菌L1C1(CNCMI-4655)16小时。将10μl 这些培养物的液滴置于胰蛋白胨琼脂(TSA)培养基表面，所述胰 蛋白胨琼脂(TSA)培养基用耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌(MRSA) ATCC43300或铜绿假单胞菌ATCC9027或脆弱拟杆菌ATCC23745 或阴沟肠杆菌CIF105132或屎肠球菌ATCC700221或奇异变形杆菌 CIP107283或化脓性链球菌ATCC19615或表皮葡萄球菌ATCC14990 或痤疮丙酸杆菌ATCC6919或白色念珠菌ATCC10231或糠秕马拉色 菌ACTT14521在琼脂培养基内提前接种(10⁶-10⁷个细胞/ml琼脂培 养基)。

放置10μl无菌MRS培养基进行阴性对照。

在37℃厌氧条件下孵育平板24小时和48小时。孵育之后，测 量液滴周围形成的抑菌圈的直径(mm).

本实验结果如表1所示。

标记“-”表明没有抑菌圈，标记“+”表明抑菌圈直径小于1mm， 标记“++”表明抑菌圈直径为1-3mm，标记“+++”表明抑菌圈直 径大于3mm。阴性对照没有抑菌圈。在测试的3个细菌菌株中均观 察到抑菌圈(参照图1)。

实施例2：细菌株LactobacillussaniviriF3C5p(CNCMI-4650)、唾液乳杆菌F50C2p(CNCMI-4651)、唾液乳杆菌F52C3p(CNCMI-4652)、唾液乳杆菌F41C3p(CNCMI-4653)、轻型链球菌F3C2v(CNCMI-4654)和戊糖乳杆菌或植物乳杆菌L1C1(CNCMI-4655)加入敷料后的抗菌活性

在ManRogosaSharpe(MRS)培养基中于37℃和厌氧条件下培养 F3C5p、F50C2p、F52C3p、F41C3p、F3C2v和L1C1细菌16小时。 将由聚氨酯泡沫和脂质水胶网组成的敷料片(1cm×1cm)用500μl 根据本发明的细菌的培养液(浓度为10⁹-10¹⁰CFU.ml^-1)浸渍，并置 于胰蛋白胨琼脂(TSA)培养基表面，所述胰蛋白胨琼脂(TSA)培 养基用10⁶-10⁷个金黄色葡萄球菌MRSAATCC43300或铜绿假单胞 菌ATCC9027细胞在琼脂培养基内提前接种。放置500μl无菌MRS 培养基进行阴性对照。

在37℃厌氧条件下孵育平板24小时和48小时。孵育之后，抑 菌圈的存在证实了抗菌活性。孵育之后，在用细菌Lactobacillus saniviriF3C5p、唾液乳杆菌F50C2p、唾液乳杆菌F52C3p、唾液乳 杆菌F41C3p、轻型链球菌F3C2v和戊糖乳杆菌或植物乳杆菌L1C1 浸渍的敷料周围肉眼观察到抑菌圈(参照图2)。在用MRS培养基 浸渍的敷料周围没有观察到抑菌圈。

实施例3：根据本发明的细菌在胶原蛋白上的附着能力

在13天的EpiSkin(SkinEthic)型重组表皮(1.07cm²)上进行 LactobacillussaniviriF3C5p、唾液乳杆菌F50C2p、唾液乳杆菌 F52C3p、唾液乳杆菌F41C3p、轻型链球菌F3C2v和戊糖乳杆菌或 植物乳杆菌L1C1细菌的附着试验。将包含所述表皮的嵌入物置于含 有2ml维持培养基的12孔板中，于35℃±2℃孵育24小时以再生表 皮。

孵育后，去除维持培养基，添加2mlMRS培养基。然后用根据 本发明的细菌(浓度大约为2.5x10⁷CFU.ml^-1)接种模拟伤口渗出液 的培养基，称为模拟伤口液(50/50vol/vol)(在Werthén等，2010中描 述)。孵育24小时后，用生理盐水洗涤去除没有附着的细菌。用解剖 刀将表皮从嵌入物分离，并放入包含9mlMRS培养基的无菌容器中。 通过机械作用(超声波浴)分离附着的细菌，并在琼脂培养基上通 过稀释平板法计数。

LactobacillussaniviriF3C5p、唾液乳杆菌F50C2p、唾液乳杆菌 F52C3p、唾液乳杆菌F41C3p、轻型链球菌F3C2v和戊糖乳杆菌或 植物乳杆菌L1C1细菌能够附着在表皮上并持续24小时。 LactobacillussaniviriF3C5p菌株显示最好的附着能力(参考图3)。

实施例4：屏障作用-在胶原蛋白表面对病原菌附着的抑制

评估LactobacillussaniviriF3C5p、唾液乳杆菌F50C2p、唾液乳 杆菌F52C3p、唾液乳杆菌F41C3p、轻型链球菌F3C2v和戊糖乳杆 菌或植物乳杆菌L1C1细菌菌株在包含胶原蛋白的基质上限制和/或 抑制病原性种类(金黄色葡萄球菌MRSAATCC43300或铜绿假单胞 菌ATCC9027)附着的能力。在用I型胶原蛋白(BDBiocoat^TMCollagen I)包被的24孔微板中进行试验。

在胰蛋白胨肉汤(TSB)培养基中于37℃培养病原菌16小时。 孵育后，在TBS培养基中稀释培养液至浓度为约2.5x10⁷CFU.ml^-1、 2.5x10⁵CFU.ml^-1和2.5x10³CFU.ml^-1。

在ManRogosaSharpe(MRS)培养基中于37℃和厌氧条件下培养 LactobacillussaniviriF3C5p、唾液乳杆菌F50C2p、唾液乳杆菌 F52C3p、唾液乳杆菌F41C3p、轻型链球菌F3C2v和戊糖乳杆菌或 植物乳杆菌L1C1细菌16小时。

对于附着竞争试验，分别以约2.5x10⁷CFU.ml^-1、2.5x10⁷CFU.ml^-1或2.5x10⁵CFU.ml^-1或2.5x10³CFU.ml^-1(病原菌)的浓度同时添加 F3C5p、F50C2p和F52C3p细菌以及病原菌(金黄色葡萄球菌或铜 绿假单胞菌)。分别以约2.5x10⁷CFU.ml^-1和2.5x10⁷CFU.ml^-1的浓度 同时添加F41C3p、F3C2v、L1C1细菌以及病原菌(金黄色葡萄球菌 或铜绿假单胞菌)。

对于排除试验，以约2.5x10⁷CFU.ml^-1的浓度将F3C5p、F50C2p 和F52C3p细菌引入孔，并在37℃下孵育24小时。附着之后，用生 理盐水洗涤孔，并以约2.5x10⁷CFU.ml^-1或2.5x10⁵CFU.ml^-1或 2.5x10³CFU.ml^-1的浓度将病原性菌株(金黄色葡萄球菌或铜绿假单 胞菌)引入所述孔。以浓度为约2.5x10⁷CFU.ml^-1的病原性菌株测试 浓度为约2.5x10⁷CFU.ml^-1的F41C3p、F3C2v和L1C1细菌。

对于各试验，接触24小时后，在补充有包含亚碲酸钾(金黄色葡 萄球菌)或头孢菌素/梭链孢酸钠/溴化十六烷基三甲铵(CFC)基质(铜 绿假单胞菌)的蛋黄乳液的Baird-Parker培养基上特异性计数病原 菌。在35℃±2℃下孵育24小时后，计数特征性克隆。对各试验用 本发明的细菌进行非处理对照。

在测试的三个浓度下与非处理对照相比，F3C5p、F50C2p、 F52C3p、F41C3p、F3C2v和L1C1细菌可以强烈限制金黄色葡萄球 菌的附着以及在胶原蛋白包被的底物上的定植(参考图4和图5)。

在初始污染小于10⁵CFU/cm²时与非处理对照相比，F3C5p、 F50C2p、F52C3p、F41C3p、F3C2v和L1C1细菌可以限制铜绿假单 胞菌的附着以及在胶原蛋白包被的底物上的定植(参考图6和图7)。

实施例5：对巨噬细胞的免疫调节活性

在ManRogosaSharpe(MRS)培养基中于37℃和厌氧条件下培养 LactobacillussaniviriF3C5p、唾液乳杆菌F50C2p、唾液乳杆菌 F52C3、戊糖乳杆菌/植物乳杆菌L1C1、唾液乳杆菌F41C3p和轻型 链球菌F3C2v菌株16小时。离心回收细菌，然后超声灭活或加热灭 活(95℃)以获得细菌提取物。

在RoswellParkMemorialInstitute(RPMI)培养基中培养THP1 单核细胞(ATCCTIB-202)，然后添加佛波酯(PMA)使其分化成巨 噬细胞。培养24小时后，将所得巨噬细胞暴露于(i)单独的细菌提 取物；或(ii)来自大肠杆菌O127：B8的LPS；或(iii)在细胞提取 物存在下的来自大肠杆菌O127：B8的LPS。接触3.5小时后，采用 ELISA法测量培养基上清液中肿瘤坏死因子(TNF-α)的浓度。

与不含细胞提取物的对照相比，添加单独的细菌提取物不诱导 任何TNF-α的明显释放，因此不诱导任何促炎性反应，其中L1C1 菌株是例外，其诱导了很弱的TNF-α释放(浓度为121pg/ml)。

用来自大肠杆菌的LPS刺激巨噬细胞在不存在细菌提取物的情 况下造成TNF-α的大量释放(浓度约500pg/ml)。从各种细菌菌株 (F3C5p、F41C3p、F50C2p、F52C3p、L1C1或F3C2v)制备的细胞提 取物与LPS的同时添加可以显著降低(2-5倍)巨噬细胞的TNF-α 释放。这些结果表明了6个乳酸菌菌株的抗炎潜力。

本申请引用的文献如下：

1.BrachkovaMI，MarquesP，RochaJ，SepodesB，DuarteMA， PintoJF(2011).AlginatefilmscontainingLactobacillusplantarumas wounddressingforpreventionofburninfection.J.Hosp.Infect.79： 375-377

2.Costerton，J.W.，Stewart，P.S.andGreenberg，E.P.(1999). Bacterialbiofilms：acommoncauseofpersistentinfections.Science284 (5418)：1318-1322

3.GanBS，KimJ，ReidG，CadieuxP，HowardJC(2002). LactobacillusfermentumRC-14inhibitsStaphylococcusaureus infectionofsurgicalimplantsinrats.J.Infect.Dis.185：1369-1372

4.GuenicheA，HenninoA，GoujonC，DahelK，BastienP，Martin R，JourdainR，BretonL(2006).Improvementofatopicdermatitisskin symptomsbyVitreoscillafiliformisbacterialextract.Eur.J.Dermatol. 16：380-384

5.GuenicheA，BuetlerT，BenyacoubJ，BlumS(2008a). Lactobacillusjohnsoniiprovidesadose-dependentprotectionagainst UVR-inducedimmunosuppression.Eur.J.Dermatol.18：476-477

6.GuenicheA，CathelineauAC，BastienP，EsdaileJ，MartinR， QueilleRousselC，BretonL(2008b).Vitreoscillafiliformisbiomass improvesseborrheicdermatitis.J.Eur.Acad.Dermatol.Venereol.22： 1014-1015

7.GuenicheA，DahelK，BastienP，MartinR，NicolasJF，BretonL (2008c).Vitreoscillafiliformisbacterialextracttoimprovetheefficacy ofemollientusedinatopicdermatitissymptoms.J.Eur.Acad.Dermatol. Venereol.22：746-747

8.GuenicheA，KnaudtB，SchuckE，VolzT，BastienP，MartinR， RockenM，BretonL，BiedermannT(2008d).Effectsofnonpathogenic gram-negativebacteriumVitreoscillafiliformislysateonatopic dermatitis：aprospective，randomized，double-blind，placebo-controlled clinicalstudy.Br.J.Dermatol.159：1357-1363

9.GuenicheA，BastienP，OvigneJM，KermiciM，CourchayG， ChevalierV，BretonL，Castiel-HigounencI(2009).Bifidobacterium longumlysate，anewingredientforreactiveskin.Exp.Dermatol.19： e1-8

10.GuenicheA，BenyacoubJ，PhilippeD，BastienP，KusyN， BretonL，BlumS，Castiel-HigounencI(2010).Lactobacillusparacasei CNCMI-2116(ST11)inhibitssubstanceP-inducedskininflammation andacceleratesskinbarrierfunctionrecoveryinVitro.Eur.J.Dermatol. 20：731-737

11.HalperJ，LeshinLS，LewisSJ，LiWI(2003).Woundhealing andangiogenicpropertiesofsupernatantsfromLactobacilluscultures. ExpBiolMed228：1329-1337

12.OhS，KimSH，KoY，SimJH，KimKS，LeeSH，ParkS，Kim YJ(2006).EffectofbacteriocinproducedbyLactococcussp.HY449 onskin-inflammatorybacteria.FoodandChemicalToxicology44(2006) 1184-1190

13.ImE，ChoiYJ，KimCH，FiocchiC，PothoulakisC，RheeSH (2009).TheangiogeniceffectofprobioticBacilluspolyfermenticuson humanintestinalmicrovascularendothelialcellsismediatedbyIL-8. Am.J.Physiol.Gastrointest.LiverPhysiol.297：G999-G1008

14.Mi-SunKangMS，OhJS，LeeSW，LimHS，ChoiNK，andKim SM(2012).EffectofLactobacillusreuteriontheproliferationof PropionibacteriumacnesandStaphylococcusepidermidis.TheJournal ofMicrobiology(2012)Vol.50，No.1，pp.137-142

15.PeralMC，MartinezMA，ValdezJC(2009).Bacteriotherapy withLactobacillusplantaruminburns.Int.WoundJ.6：73-81

16.PeralMC，RachidMM，GobbatoNM，HuamanMartinezMA， ValdezJC(2010).Interleukin-8productionbypolymorphonuclear leukocytesfrompatientswithchronicinfectedlegulcerstreatedwith Lactobacillusplantarum.Clin.Microbiol.Infect.16：281-286

17.RamosAN，GobbatoN，RachidM，GonzalezL，YantornoO， ValdezJC(2010).EffectofLactobacillusplantarumandPseudomonas aeruginosaculturesupernatantsonpolymorphonucleardamageand inflammatoryresponse.Int.Immunopharmacol.10：247-251

18.SikorskaH，SmoragiewiczbW(2013).Roleofprobioticsinthe preventionandtreatmentofmeticillin-resistantStaphylococcusaureus infections.InternationalJournalofAntimicrobialAgents42(2013) 475-481

19.ValdezJC，PeralMC，RachidM，SantanaM，PerdigonG(2005). InterferenceofLactobacillusplantarumwithPseudomonasaeruginosain vitroandininfectedburns：thepotentialuseofprobioticsinwound treatment.Clin.Microbiol.Infect.11：472-479

20.AlbertoN.Ramos，MaríaE.SestoCabral，DiegoNoseda， AlejandraBosch，OsvaldoM.Yantorno，JuanC.Valdez，(2012). AntipathogenicpropertiesofLactobacillusplantarumonPseudomonas aeruginosa：Thepotentialuseofitssupernatantsinthetreatmentof infectedchronicwounds.WoundRepReg(2012)。