pcDNA3-HIF-1α真核表达质粒的构建及其在MCF-7细胞中的表达

摘要

目的 构建低氧诱导因子1α(HIF-1α)真核表达质粒,并在MCF-7细胞中进行功能验证.方法 利用RT-PCR扩增带有Xba Ⅰ和HindⅢ酶切位点的HIF-1α编码基因,插入T载体测序正确后,克隆入pcDNA3真核表达载体,然后将其转染MCF-7细胞.Western blot和双荧光素酶报告基因法分别检测HIF-1α表达及其DNA结合活性;实时定量PCR检测HIF-1α对低氧诱导基因C-MET mRNA表达的影响;Caspase3/7活性检测来初步判断HIF-1α对低氧MCF-7细胞凋亡的影响.结果 酶切及测序结果 证明pcDNA3-HIF-1α表达质粒的DNA序列完全正确.将此质粒转染MCF-7细胞后,HIF-1α蛋白表达明显增加,它不仅增强了pGL3-EPO-HRE报告基因活性而且促进了C-MET mRNA的表达,同时还降低了低氧MCF-7细胞中Caspase3/7的水平.结论 pcDNA3-HIF-1α真核表达质粒构建成功,它不但具有很强的DNA结合和诱导活性,而且在细胞低氧过程中具有一定的抗凋亡作用.