慢病毒介导的SMO RNA干扰对肿瘤细胞株LNCaP和PC3 SMO基因表达、细胞增殖及细胞周期的影响

摘要

原癌基因Smoothened(SMO)是Hedgehog旁路途径的重要组成成分,具有开关该信号通路的作用.我们构建特异性沉默SMO基因(NM 005631)的重组慢病毒载体,观察其对雄激素敏感性的人前列腺癌细胞株LNCaP和雄激素非依赖性的细胞株PC3中SM(O)因表达、细胞增殖、细胞周期的影响.根据SMO基因信息,设计了四个小干扰序列和一个阴性对照序列,利用慢病毒质粒载体pGCSIL-GFP构建了四个重组质粒.用脂质体将重组慢病毒载体转染293T细胞后,选择沉默效率高的质粒载体进行慢病毒颗粒大量包装.用脂质体将重组慢病毒载体与病毒包装载体pHelper1.0、pHelper2.0共转染293T细胞生产慢病毒颗粒,用慢病毒颗粒感染前列腺癌细胞株LNCaP和PC3后,用定量PCR检测SMO基因mRNA;细胞增殖实验检测细胞增殖的变化;用流式细胞仪检测转染效率和细胞周期的变化.测序结果证明4个重组慢病毒质粒载体插入序列完全正确,其中pGCSIL-GFP-723的干扰效率最高,后用Lv-SIL-SM0723命名该载体.用LV-SIL-SMO723慢病毒颗粒感染前列腺癌细胞株LNCaP和PC3.其中LNCaP和PC3 SMO mRNA显著下调,LNCaP细胞生长明显减缓,S期细胞减少、G_2/M期细胞增多,与未转染病毒、转染阴性对照病毒的LnCap细胞比较有显著差异(P<0.05).但对PC3细胞增殖没有改变(P>0.05).综上所述,本研究成功构建了特异性沉默SMO基因慢病毒载体,其产生的慢病毒颗粒能特异地沉默SMO基因,抑制LNCaP细胞增殖,但对PC3无作用.