基因组编辑对酿酒酵母DNA的损伤作用及修复响应

摘要

[目的]为了研究基因组编辑工具CRISPR/Cas9和CRISPR/Cpf1所产生的DNA双链断裂(DNA double strand break,DSB)对酿酒酵母DNA的损伤作用及修复响应情况,对比化学物质甲基磺酸甲酯(methyl methanesulfonate,MMS)对酿酒酵母基因组DNA的损伤和修复,阐明编辑细胞在细胞水平和转录水平上的变化.[方法]起始细胞分为两种情况,包括未进行细胞周期同步化和被α-因子同步化细胞周期至G0/G1期.检测CRISPR/Cas9和CRISPR/Cpf1处理后编辑细胞的生长情况.利用流式细胞术检测编辑细胞的细胞周期延滞的情况.利用荧光定量PCR检测编辑细胞和MMS处理细胞后DNA损伤响应关键基因转录表达水平的变化情况.[结果]起始细胞无论是未同步化还是同步化,其生长均受到基因组编辑抑制,细胞存活率降低,细胞周期被滞留在G2/M期,而MMS处理导致细胞周期S期的滞留.此外,随编辑时间的延长,突变率增加,细胞存活率降低.CRISPR/Cpf1编辑细胞的突变率和存活率均低于CRISPR/Cas9,由此可见,CRISPR/Cpf1对细胞的损伤强度高于CRISPR/Cas9.两种编辑均诱导酵母DNA损伤响应关键基因RNR3及HUG1转录水平显著上调,并且CRISPR/Cpf1介导的上调幅度大于CRISPR/Cas9,但两者均低于MMS的处理.[结论]本研究解析了CRISPR/Cas9和CRISPR/Cpf1介导的基因组编辑在细胞水平和转录水平上对DNA损伤作用及修复响应,初步揭示了酿酒酵母应对不同类型的DSB损伤时响应程度的差异,为提高基因组编辑工具的编辑能力和评估基因编辑安全性提供了重要依据.