3α-羟类固醇脱氢酶的表达、纯化和酶学性质研究

摘要

从土壤中分离睾酮丛毛单胞菌,提取其基因组DNA,PCR扩增3α-羟类固醇脱氢酶(3α-HSD)基因.以质粒pET-15b为载体,构建3α-HSD的原核表达系统.经IPTG诱导后,得到了具有酶活性的融合蛋白,细菌总蛋白的表达量为0.73g/L,其中融合酶蛋白占16.4%,活性达1.38×105U/L.利用融合蛋白N末端的His-tag,经金属螯合亲和层析纯化后,得到了纯度较高的融合酶蛋白,酶蛋白的得率为68%,比活性为194.7U/mg.凝血酶切除His-tag后,经质谱鉴定,重组蛋白的分子量为26.5kD,与理论推测值基本相同.25℃以雄酮为底物,以NAD+和thio-NAD+为辅因子时,融合蛋白参与酶促反应的最适pH分别为10.5和9.4.37℃条件下酶促反应较快,25℃时的反应速度只有37℃时的52%,Q10(25℃～35℃)为1.7.25℃、pH10.5、以雄酮和各级胆汁酸为底物、NAD+为辅因子时,融合酶蛋白的动力学常数Km位于4.2～51.1μmol/L范围内.融合酶蛋白发挥催化作用并不需要金属离子的参与,而Fe3+、Fe2+、Zn2+则抑制酶活性,反应体系中加入EDTA也并不影响酶的活性.活性和纯度均较高的融合蛋白3α-HSD的获得及其生物学性质的研究,为血清总胆汁酸酶循环法测定的建立奠定了基础.