金龟子绿僵菌中性海藻糖酶基因的克隆及其表达特性分析

摘要

根据中性海藻糖酶NTL基因的同源序列设计引物,PCR扩增出杀蝗专一菌株--金龟子绿僵菌CQMa102 NTL基因片段,利用5′-RACE和3′-RACE扩增出NTL cDNA的5′和3′端序列,经拼接得到CQMa102 NTL基因 cDNA全长.根据其全长cDNA序列,设计引物PCR扩增出CQMa102 NTL的完整基因.为了解该基因的上游调控信息,采用Panhandle Polymerase Chain Reaction Amplification方法扩增其上游序列.序列分析表明, CQMa102 NTL全长DNA 3484bp, cDNA 全长2385bp,编码737个氨基酸的蛋白,推测蛋白分子量为83.1kD;含有3个内含子,包含一个依赖于cAMP的磷酸化作用位点(RRGS)和一个钙附着位点(DTDGNMQITIED);上游序列含有一个压力反应元件(CCCCT);与金龟子绿僵菌广谱性菌株ME1 NTL的核苷酸序列和氨基酸序列分别具有93%和99%同源性,由此确定该序列为金龟子绿僵菌中性海藻糖酶基因序列.Southern杂交表明,NTL基因在CQMa102基因组中为单拷贝.Northern杂交表明,NTL基因转录出约2.5kb的mRNA单带,在液体培养条件下,对数生长前期表达水平最高,对数生长后期降到最低,进入稳定生长期后表达水平又有所提高.金龟子绿僵菌CQMa102 中性海藻糖酶基因 DNA全长和cDNA全长登录GenBank,登录号分别为:AY557613,AY557612.