核盘菌arom基因的克隆及其在酿酒酵母中的表达

摘要

核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)arom基因已经被克隆、测序.该基因编码的AROM蛋白是芳香族氨基酸合成途径中催化第二步到第六步的五功能多肽.为了对扩增的核盘菌arom基因进行功能验证和探索大量获得AROM蛋白的成熟方法,克隆了arom基因的编码框序列,并将其与载体pYES2连接,构建了酵母表达载体pYES2-arom.用LiAc/SSDNA/PEG方法将该表达载体转入酿酒酵母H158(Saccharomyces cerevisiae H158)中.酶活测定、RT-PCR和Northern杂交结果显示,核盘菌arom基因在酿酒酵母胞内获得了表达,转化子具有AROM蛋白结构域之一5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶的催化活性.不同培养时间取样样品的酶活检测结果表明,当转化子在30℃的条件下,在SC-U酵母尿嘧啶营养缺陷型选择培养基中以180r/min被振荡培养时,其外源AROM蛋白的5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶酶活在培养72h达到最高.