多鳞白甲鱼X型凝集素(OmITLN)基因克隆及在抗菌免疫中的功能研究

摘要

为探究秦巴山溪半洞穴鱼类——多鳞白甲鱼的先天性免疫因子X型凝集素的免疫功能,研究从多鳞白甲鱼(Onychostoma macrolepis)肝脏转录组数据库筛选出一种Intelectin基因片段,通过克隆鉴定获得Intelectin基因cDNA序列全长,命名为OmITLN;采用qRT-PCR分析OmITLN基因在健康多鳞白甲鱼8个组织和嗜水气单胞菌感染后两个免疫组织的表达情况;构建OmITLN基因的原核表达载体并在大肠杆菌BL21中诱导表达,获得OmITLN重组蛋白,采用ELISA法以及荧光标记法检测OmITLN对病原菌的凝集效果及糖结合情况。结果显示,OmITLN是一种X型凝集素基因,其cDNA全长960 bp,编码315个氨基酸。OmITLN蛋白含有1个N端的纤维蛋白原相关结构域(Fibrinogen-Related Domain,FReD)和1个C端Intelectin特异性区域,不具有信号肽和跨膜区。系统进化树分析发现,OmITLN与鲫、团头鲂、鳙、草鱼等鲤科鱼类的Intelectin聚为一支,亲缘关系最近。OmITLN基因在所检测组织均有表达,且在脾脏和肝脏中的表达量最高。腹腔注射1.65×107 CFU/尾的嗜水气单胞菌后,OmITLN基因在感染鱼的脾脏和肝脏组织的表达量均呈先上调后下降的趋势,但表达量达到最高值的时间不同,表明其两个组织对嗜水气单胞菌感染均有不同程度的免疫响应。试验利用原核表达系统成功纯化获得体外重组蛋白OmITLN,OmITLN重组蛋白对副溶血弧菌、嗜水气单胞菌、大肠杆菌、无乳链球菌、蜡状芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌均具有不同程度凝集作用。OmITLN重组蛋白对D-乳糖的结合活性最好,木糖、D-半乳糖、蔗糖和D-葡萄糖的结合活性次之,对海藻糖、D-果糖和D-麦芽糖没有结合活性;对肽聚糖(PGN)的结合活性高于脂多糖(LPS)。OmITLN作为重要的模式识别受体,参与了多鳞白甲鱼应答病原菌感染的防御过程。