桦褐孔菌酸性蛋白酶的基因克隆及其在菌核中的表达

摘要

根据桦褐孔菌(Inonotus obliquus)酸性蛋白酶(Acid protease,AP)基因(IO-AP)序列密码子的偏好性优化选择酶切位点和载体,成功构建pGEX-4 T1-IO-AP原核表达载体;用热激法将该载体转化到大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)中,构建桦褐孔菌酸性蛋白酶(IO-AP)重组菌.以此重组菌表达的IO-AP以包涵体形式存在,重组蛋白分子质量约为60 kDa.以获得的较高纯度的重组IO-AP作为免疫原,采用传统3-2-2-2免疫方式免疫4只Balb/c小鼠,通过间接ELISA法测定抗血清效价,4免之后,4只小鼠抗血清效价均大于121500,成功制备了IO-AP多克隆抗体.Western Blotting检测表明,IO-AP在桦褐孔菌菌核形成过程中的表达呈现先上升后下降的趋势,以第二个时期(栽培130 d,菌核长至1.33 g时)AP蛋白表达量最高.