牛源耐药性金黄色葡萄球菌的分离鉴定及黏附因子基因FnBP和clfA的表达分析

摘要

为探究致奶牛乳房炎主要致病菌金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus,S.aureus)的生物学特性,对新疆垦区部分奶牛场乳房炎奶样进行病原学分析,并对病原菌进行耐药性、毒力因子的表达分析.从乳房炎奶样中分离得到S.aureus,采用血浆凝固酶试验、KB法、琼脂筛选法、生化鉴定法(VITEK32)、聚合酶链式反应等法进行鉴定.针对毒力基因clfA(凝集因子A)和FnBP(纤维结合素结合蛋白)进行特异性PCR扩增,用T/A克隆法将其插入pMD18-T载体,并构建原核表达载体pET-28a(+)-FnBP和pET-28a(+)-clfA.转化BL21(DE3)菌,经IPTG诱导表达,通过SDS-PAGE和Western blot分析鉴定表达产物.常规鉴定出葡萄球菌105株,其中金黄色葡萄球菌(S.aureus)62株,从62株S.aureus中检出耐药性金黄色葡萄球菌(MRSA) 13株,检出率为20.10％,2株未确检.经测序证实与GenBank中FnBP基因(J04151)和clfA基因(AB245457)序列同源性分别为100％和95.69％.SDS-PAGE显示,clfA和FnBP蛋白相对分子质量分别为45 ku和58 ku.Western blot分析显示,clfA蛋白和FnBP蛋白均可与金黄色葡萄球菌多克隆抗血清发生特异性反应.病畜奶样中MRSA检出率较高,新疆垦区部分牛场呈蔓延趋势,成功表达了clfA、FnBP蛋白,具有一定的免疫保护效果.