尾侧型同源转录因子2慢病毒载体的构建及其转染骨髓间充质干细胞的实验研究

摘要

目的构建携带尾侧型同源转录因子2（caudal-related homeobox transcription factor 2,CDX2）的大鼠骨髓间充质干细胞（bone mesenchymal stem cells,BMSCs）,为大鼠溃疡性结肠炎模型的基因治疗提供工具。方法根据Gen Bank信息,设计CDX2引物,采用PCR扩增CDX2基因片段;通过In-Fusion技术将目的基因片段连接到线性质粒载体中,然后转化感受态细胞,进行阳性克隆筛选及基因测序。将重组载体转染293T细胞,进行慢病毒包装、浓缩及滴度测定。体外分离并培养Wistar大鼠骨髓间充质干细胞,流式细胞仪（fluorescence activated cell sorting,FACS）检测细胞免疫表型。将携带CDX2基因的慢病毒载体转染至大鼠骨髓间充质干细胞,利用RT-PCR及Western blot等技术检测CDX2基因及蛋白的表达水平。结果 PCR、DNA测序及Western blot检测成功构建重组Ubi-CDX2-MCS-3FLAG-CMV-EGFP GV365慢病毒载体,测定滴度为2×108 TU/ml;成功完成大鼠骨髓间充质干细胞的分离与培养,FACS结果显示,大鼠BMSCs表达CD29、CD73、CD90和CD105,而不表达CD34和CD45,符合骨髓间充质干细胞的表型。成功构建携带CDX2基因的BMSCs,RT-PCR及Western blot结果显示CDX2基因转染至大鼠BMSCs并能稳定表达。结论本研究成功构建了携带CDX2基因的大鼠BMSCs并稳定表达CDX2,为溃疡性结肠炎基因治疗的实验性研究提供了一种新的工具。