Specificite enzymatique et regulation fonctionnelle de la matriptase-2, une protease a serine transmembranaire de type II essentielle a l'homeostasie du fer.

摘要

Les proteases a serine transmembranaires de type II (TTSP) forment une famille d'enzymes proteolytiques nouvellement identifiee dont les roles physiologiques restent encore peu connus. Ces enzymes seraient, entre autres, impliques dans la formation des tissus et leur deregulation est reliee a de nombreux types de cancers. Recemment, une fonction essentielle dans la regulation de l'homeostasie du fer a ete attribuee a l'un de ses membres, la matriptase-2 (TMPRSS6). Cet enzyme exerce ce role en controlant l'expression de l'hepcidine, une hormone importante dans la regulation du fer. Afin de mieux comprendre cette fonction de la matriptase-2, dans ce travail nous avons compare ses proprietes enzymatiques a celles de trois autres TTSP ainsi qu'analyser son mecanisme de regulation fonctionnel.;Nous demontrons aussi l'importance de la regulation de la matriptase-2 a la membrane plasmique dans le controle de l'expression de l'hepcidine. Nous rapportons que la matriptase2 subit une internalisation constitutive dans les cellules HEK293 transfectees ainsi que dans deux lignees cellulaires hepatiques humaines, les HepG2 et les hepatocytes primaires, tous les deux exprimant la matriptase-2 endogenement. La matriptase-2 marquee a la surface cellulaire est internalisee puis detectee dans des vesicules contenant de la clathrine et la proteine AP-2 pour ensuite se retrouver dans les endosomes precoces puis les lysosomes. L'internalisation de la matriptase-2 depend de residus specifiques situes dans la portion amino-terminale de sa queue cytoplasmique, comme le demontre les resultats de la mutagenese dirigee de ces residus. Les cellules qui expriment ces mutants produisent des niveaux significativement diminues d'hepcidine comparees a celles exprimant la forme sauvage car les formes mutantes s'accumulent a la surface cellulaire et clivent davantage l'hemojuveline.;Mots-cles : TTSP, protease, matriptase-2, TMPRSS6, specificite enzymatique, internalisation.;Nous demontrons que la matriptase-2 possede des preferences de substrats distinctes. Sa specificite a ete comparee a celles de la matriptase, de l'hepsine et de DESC1 en utilisant des peptides-substrats a fluorescence sequestree. La sequence des peptides utilises est basee sur la region P4 a P4' de la sequence d'activation de la matriptase (RQAR4.WGG). Les positions P4, P3, P2 et 131' ont ete substituees par des acides amines de natures differentes (non-polaire, aromatique, acide et basique) alors que la position P1 a ete fixee a Arg. Des quatre TTSP etudiees, la matriptase-2 est la plus permissive alors que la matriptase est la plus discriminante. DESC1 possede une preference similaire a celle de la matriptase, mais avec une tendance pour les petits acides amines non-polaires (Ala) en P1'. En presence de serpines, seulement AT III demontre une activite d'inhibition robuste. La matriptase-2 ainsi que l'hepsine et DESC1 sont aussi fortement inhibees en presence de PAI-1 et de "2-AP. La matriptase-2 est aussi la seule a presenter une inhibition par certains des substrats.