Spécificité enzymatique et régulation fonctionnelle de la matriptase-2, une protéase à sérine transmembranaire de type II essentielle à l'homéostasie du fer

摘要

Les protéases à sérine transmembranaires de type II (TTSP) forment une famille d'enzymes protéolytiques nouvellement identifiée dont les rôles physiologiques restent encore peu connus. Ces enzymes seraient, entre autres, impliqués dans la formation des tissus et leur dérégulation est reliée à de nombreux types de cancers. Récemment, une fonction essentielle dans la régulation de l'homéostasie du fer a été attribuée à l'un de ses membres, la matriptase-2 (TMPRSS6). Cet enzyme exerce ce rôle en contrôlant l'expression de l'hepcidine, une hormone importante dans la régulation du fer. Afin de mieux comprendre cette fonction de la matriptase-2, dans ce travail nous avons comparé ses propriétés enzymatiques à celles de trois autres TTSP ainsi qu'analyser son mécanisme de régulation fonctionnel. Nous démontrons que la matriptase-2 possède des préférences de substrats distinctes. Sa spécificité a été comparée à celles de la matriptase, de l'hepsine et de DESC1 en utilisant des peptides-substrats à fluorescence séquestrée. La séquence des peptides utilisés est basée sur la région P4 à P4' de la séquence d'activation de la matriptase (RQARTWGG). Les positions P4, P3, P2 et PI' ont été substituées par des acides aminés de natures différentes (non-polaire, aromatique, acide et basique) alors que la position PI a été fixée à Arg. Des quatre TTSP étudiées, la matriptase-2 est la plus permissive alors que la matriptase est la plus discriminante. DESC1 possède une préférence similaire à celle de la matriptase, mais avec une tendance pour les petits acides aminés non-polaires (Ala) en PI'. En présence de serpines, seulement AT III démontre une activité d'inhibition robuste. La matriptase-2 ainsi que l'hepsine et DESC1 sont aussi fortement inhibées en présence de PAI-1 et de [alpha][indice inférieur 2]-AP. La matriptase-2 est aussi la seule à présenter une inhibition par certains des substrats. Nous démontrons aussi l'importance de la régulation de la matriptase-2 à la membrane plasmique dans le contrôle de l'expression de l'hepcidine. Nous rapportons que la matriptase-2 subit une internalisation constitutive dans les cellules HEK293 transfectées ainsi que dans deux lignées cellulaires hépatiques humaines, les HepG2 et les hépatocytes primaires, tous les deux exprimant la matriptase-2 endogènement. La matriptase-2 marquée à la surface cellulaire est internalisée puis détectée dans des vésicules contenant de la clathrine et la protéine AP-2 pour ensuite se retrouver dans les endosomes précoces puis les lysosomes. L'internalisation de la matriptase-2 dépend de résidus spécifiques situés dans la portion amino-terminale de sa queue cytoplasmique, comme le démontre [i.e. démontrent] les résultats de la mutagénèse dirigée de ces résidus. Les cellules qui expriment ces mutants produisent des niveaux significativement diminués d'hepcidine comparées à celles exprimant la forme sauvage car les formes mutantes s'accumulent à la surface cellulaire et clivent davantage l'hémojuvéline.