GIPC2相互作用蛋白的研究

摘要

目的:GIPC2是一种天然的小分子蛋白，现发现其在多种肿瘤中存在表达量的变化，如GIPC2在胃癌中上调，在肾癌、急性淋巴细胞白血病和肾上腺皮质癌中却下调。然而到目前为止GIPC2在肿瘤发生中的功能尚不清楚，研究报道GIPC2的相互作用蛋白也很少。因此，本研究旨在寻找GIPC2的相互作用蛋白，从而为研究GIPC2的生物学功能提供有价值的线索。
　　方法:以酵母双杂交(H2Y)和免疫沉淀-质谱联用两种方法进行GIPC2相互作用蛋白的初筛，主要从GIPC2 PDZ结构域筛选PDZ配体文库、GIPC2筛选cDNA文库及GIPC2筛选293T细胞表达蛋白三条路线进行研究。首先通过生物学功能对初筛结果进行筛选得到候选蛋白，再根据蛋白表达的组织特异性和种属特异性，在PC12和293T等细胞中通过荧光共振能量转移(FRET)、免疫共沉淀(CO-IP)等方法进行相互作用蛋白的验证。
　　结果:在酵母双杂交系统中，通过GIPC2 PDZ结构域筛选PDZ配体文库的方法，得到14个GIPC2的候选配体蛋白;通过GIPC2筛选cDNA文库的方法得到4个GIPC2的候选配体蛋白。利用免疫沉淀-质谱联用的方法在293T细胞中筛选到上百种可能的配体蛋白。将以上得到的所有候选蛋白从生物学功能和亚细胞定位等方面进行进一步筛选，共得到19个候选蛋白。在PC12细胞中，利用FRET的方法对GIPC2和19个候选蛋白的相互作用进行验证，均呈阳性。在293T细胞中，通过CO-IP验证，确定NONO为GIPC2的相互作用蛋白。
　　结论:通过酵母双杂交、免疫沉淀-质谱联用、荧光共振能量转移、免疫共沉淀等方法，我们成功筛选并验证得到GIPC2新的相互作用蛋白，为GIPC2相关生物学功能的研究提供重要的线索。

目录

摘要

第一章 引言

1．1，GIPC2相关介绍

1．2，PDZ结构域相关介绍

1．3，待解决问题

1．4，研究要点与技术流程

第二章 GIPC2相互作用蛋白的初筛

2．1 前言

2．1．1，酵母双杂交实验原理

2．1．2，免疫沉淀-质谱联用实验原理

2．2 实验材料

2．3 实验方法

2．3．1 通过配体文库研究GIPC2 PDZ配体结合特点及其相互作用蛋白

2．3．2 通过筛选cDNA文库研究GIPC2的相互作用蛋白

2．3．3 通过免疫沉淀-质谱联用的方法研究293T细胞中GIPC2的相互作用蛋白

2．4 实验结果

2．4．1 通过配体文库研究GIPC2 PD2祝体结合特点及其相互作用蛋白

2．4．2 通过筛选cDNA文库研究GIPC2的相互作用蛋白

2．4．3 通过免疫沉淀-质谱联用的方法研究293T细胞中GIPC2的相互作用蛋白

2．4．4 结果总结

2．5 实验讨论

第三章 GIPC2相互作用蛋白的验证

3．1 前言

3．1．1 荧光共振能量转移实验原理

3．1．2 免疫共沉淀实验原理

3．1．3 NONO相关介绍

3．2 实验材料

3．3 实验方法

3．3．1 利用FRET的实验方法验证初筛所得配体蛋白与GIPC2的相互作用

3．3．2 利用CO-IP的方法验证有意义配体蛋白与GIPC2的相互作用

3．4 实验结果

3．4．1 利用FRET的实验方法验证初筛所得配体蛋白与GIPC2的相互作用

3．4．2 利用CO-IP的方法验证有意义配体蛋白与GIPC2的相互作用

3．4 实验讨论

第四章 实验结论

参考文献

附录

致谢

个人简历

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