诺如病毒P结构域与EV71中和表位的嵌合蛋白及其特征研究

摘要

肠道病毒71型(Enterovirus71，EV71)是导致5岁以下儿童患手足口病(hand-foot-and-mouth disease，HFMD)的主要病原体之一，同时该病毒具有嗜神经组织的特性，致死率和致残率都很高。诺如病毒(Norovirus，NoV)是造成儿童和成人非细菌性急性胃肠炎流行的重要原因。这两种病毒都对人类的健康构成了不可忽视的威胁，研制有效的疫苗是防治它们最有效的途径之一。
　　本研究的目的是获得含有EV71线性中和表位和诺如病毒P结构域的嵌合蛋白，并对其进行初步的免疫原性评价，主要包括了3个部分的研究内容。第一部分，运用基因克隆的技术，将文献报道的3个EV71线性中和表位以单个或串联的形式分别克隆到含诺如病毒P结构域的原核表达质粒中，经测序验证重组质粒;第二部分，将构建正确的重组质粒转入到大肠杆菌表达系统中，通过IPTG诱导嵌合蛋白表达，并用亲和纯化的方式对嵌合蛋白进行纯化;第三部分，用纯化后的嵌合蛋白免疫小鼠，通过免疫印迹、ELISA以及中和试验对嵌合蛋白的免疫原性进行初步的评价。
　　通过以上3个部分的研究，我们取得了如下结果:1）成功构建了含EV71的3个单表位、4个串联表位与诺如病毒P结构域嵌合的重组质粒;2）这些重组质粒在大肠杆菌中所表达的7个嵌合蛋白都以部分可溶的形式存在;3）通过亲和纯化获得的P结构域和Pm+SP55-70-28嵌合蛋白都能够自发形成直径约20nm的颗粒，用这两种蛋白免疫小鼠后获得的血清抗体滴度分别是1∶32，000、1∶1，024，000;4)免疫印迹分析表明，(i)7个嵌合蛋白都能与抗诺如病毒P结构域的抗血清发生反应;(ii)除了含单表位SP55和SP28的嵌合蛋白外，其它嵌合蛋白均能与抗EV71的抗血清反应;(iii)除了P结构域蛋白、含单表位SP55和SP70以及含串联表位SP55-70的嵌合蛋白外，其它嵌合蛋白都能与抗Pm+SP55-70-28的抗血清发生反应;5）中和试验结果表明，抗Pm+SP55-70-28小鼠血清的中和抗体效价约为1∶4。
　　综上所述，本研究获得了7个含EV71线性中和表位和诺如病毒P结构域的嵌合蛋白，这些蛋白中部分具有针对EV71和诺如病毒的双重抗原性;用嵌合蛋白Pm+SP55-70-28免疫后的小鼠血清对EV71具有一定的中和作用。因此，本研究为诺如病毒和EV71二价疫苗的研发奠定了基础，同时也为基因工程疫苗的研制提供了新思路。

目录

摘要

第1章 前言

1．1 肠道病毒71型和诺如病毒

1．1．1 肠道病毒71型简介

1．1．2 诺如病毒简介

1．2．1 EV71中和表位

1．2．2 诺如病毒P颗粒

1．3 嵌合疫苗简介

1．4 本文的研究内容和研究意义

1．4．1 研究内容

1．4．2 研究意义

第2章 嵌合蛋白重组质粒的构建

2．1 引言

2．2 实验材料

2．2．1 质粒和感受态细胞

2．2．2 试剂和试剂盒

2．2．3 实验仪器

2．2．4 合成的引物、寡核苷酸和基因

2．3 实验方法

2．3．1 质粒P42的获取

2．3．2 双酶切质粒P42

2．3．3 目的基因的获取

2．3．4 目的基因的重组

2．3．5 转化(DH5α)

2．3．6 重组质粒的获取

2．3．7 重组质粒的鉴定

2．3．8 嵌合蛋白的空间结构预测

2．4 实验结果

2．4．1 含P结构域载体质粒P42的鉴定

2．4．2 酶切获取EV71的中和表位基因片段

2．4．3 PCR扩增EV71的中和表位基因片段

2．4．4 重组质粒测序验证

2．4．5 嵌合蛋白的空间结构预测

2．5 本章小结

第3章 嵌合蛋白的表达和纯化

3．1 引言

3．2．1 质粒和感受态细胞

3．2．2 实验试剂和试剂盒

3．2．3 实验仪器

3．3 实验方法

3．3．1 转化(BL21(DE3))

3．3．2 蛋白表达

3．3．3 破碎菌体

3．3．4 BeaverBeadsTM GSH磁珠纯化蛋白

3．3．5 Western blot分析

3．3．6 GSTrapTM FF(5mL)柱纯化蛋白

3．3．7 目的蛋白溶液的超滤

3．3．8 GST标签的除去

3．3．9 目的蛋白性质的初步鉴定

3．4 实验结果

3．4．1 目的蛋白的诱导表达

3．4．2 表达目的蛋白的可溶性分析

3．4．3 磁珠纯化目的蛋白

3．4．4 目的蛋白的免疫印迹分析

3．4．5 P结构域蛋白的纯化

3．4．6 Pm+SP55-70-28嵌合蛋白的纯化

3．5 本章小结

第4章 嵌合蛋白的免疫原性评价

4．1 引言

4．2 实验材料

4．2．1 小鼠

4．2．2 细胞和病毒

4．2．3 实验试剂

4．2．4 实验仪器

4．3 实验方法

4．3．1 小鼠免疫

4．3．2 ELISA分析

4．2．3 Western blot分析

4．3．4 中和试验

4．4 实验结果

4．4．1 免疫后血清的抗体滴度

4．4．2 各表位嵌合蛋白的免疫印迹分析

4．4．3 中和试验

4．5 本章小节

第5章 讨论和结论

5．1 讨论

5．2 结论

参考文献

附录

个人简介

在读期间参与发表的学术论文

在读期间参与申请的发明专利

致谢

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