受者同系骨髓间充质干细胞对大鼠心脏移植排斥反应的影响

摘要

第一部分大鼠颈部心脏移植模型的建立
　　 目的：建立成功率较高的大鼠颈部异位心脏移植模型，
　　 方法：采用自制的套管连接血管建立移植心脏血流通路：移植心脏无名动脉连接大鼠右颈总动脉，移植心脏左肺动脉连接大鼠右颈外静脉，建立大鼠颈部心脏移植模型，术后24小时移植心脏正常跳动视为移植成功。
　　 结果：建模成功率为88％(30/34)。
　　 结论：成功应用套管法建立了大鼠颈部心脏移植模型。
　　 第二部分大鼠骨髓间充质干细胞的体外分离、培养与鉴定
　　 目的：建立稳定的大鼠骨髓间充质干细胞(Mesenchymal stem cells，MSC)体外分离、培养、鉴定方法。
　　 方法：选用1月龄雄性清洁级Wistar大鼠，处死消毒后取其胫骨和股骨，用含15％胎牛血清DMEM冲洗骨髓腔，收集冲洗液，采用密度梯度离心法分离荻取细胞，培养后对贴壁细胞进行传代培养.取第3代生长状态良好的细胞，以流式细胞术鉴定细胞表型，并进行冻存复苏实验。
　　 结果：MSC在培养瓶中24h后就有细胞贴壁，第3～4d细胞生长明显，经换液去除未贴壁细胞，传代后细胞生长迅速，约6～8d即可长满培养瓶底，达融合状态，三代后即可得到较为纯化的MSC成纤维样细胞，并至少可传代10代以上，冻存对细胞生长无影响。流式细胞术检测细胞表面分子标志，显示CD11B(-)、CD29(+)、CD34(-)、CD45(-)、CD90(+)、CD106(+)。
　　 结论：通过密度梯度离心及贴壁筛选培养法获取大鼠骨髓MSC的方法简便易行，可提供稳定的大鼠MSC。
　　 第三部分受者同系骨髓间充质干细胞对大鼠心脏移植急性排斥反应的影响
　　 目的：观察受者同系骨髓MSC对大鼠心脏移植急性排斥反应的影响，并探讨MSC的免疫调节机制。
　　 方法：实验动物随机分为2组，每组10只受体，进行Lewis→Wistar颈部心脏移植：(1)空白对照组(A3组)：手术后24h，确定手术成功，即经尾静脉注射3mL0.9％氯化钠注射液；(2)MSC处理组(B3组)：手术后24h，确定手术成功，即经尾静脉注射MSC2×106(悬浮在3mL0.9％氯化钠注射液中)。术后一周，每组随机取4只大鼠，取下腔静脉血及移植物进行组织学及免疫学检查。检测项目：病理学分级，血清IL-2及IL-10，血、移植物CD4+、CD8+、CD4+CD25high、CD4+CD25Kighfoxp3+T细胞占总淋巴细胞的比例，及CD4+/CD8+比值。其余6只用以继续观察移植物存活时间.另外再建立2只大鼠心脏移植模型，术后24小时，经尾静脉注射表达绿色荧光蛋白的同系MSC(MSCGFfP)2×106，术后7天取移植心脏，冰冻切片，荧光显微镜下观察移植物内荧光细胞的分布情况。
　　 结果：(1) A3组大鼠移植心脏存活7.2±1.3d，B3组大鼠移植心脏存活14.8±2.9d。P<0.01.(2)血清IL-2: A3组为233.99±30.19pg/mL，B3组为249.11±20.34 pg/mL，P>0.1；血清IL-10: A3组为81.44±11.01 pg/mL，B3组为158.39+1±8.70 pg/mL，P<0.01.(3)病理学分级，A3组3B级1例，4级3例；B3组2级1例，3A级2例，3B级1例，B3组病理分级总体较A3组低。(4)大鼠血中CD4+/ CD8+值、CD4+CD25highT细胞占总淋巴细胞的比例、CD4+CD25highFoxp3+T细胞占总淋巴细胞的比例，B3组都明显高于A3组，差异有统计学意义(P<0.01).(5)移植心脏中CD4+/CD8+值两组之间无显著性差异，CD4+CD25high T细胞占总淋巴细胞的比例、CD4+CD25highFoxp3+T细胞占总淋巴细胞的比例，B3组都明显高于A3组，差异有统计学意义(P<0.01)。(6)心脏移植术后24h，经尾静脉向受体大鼠注射同系MSCGFP后6天，荧光显微镜下观察移植心脏冰冻切片可见荧光细胞在移植心脏表面分布较集中，并向心肌组织浸润，形态及分布类似心肌细胞。
　　 结论：静脉注射受者同系骨髓MSC，可以延长大鼠颈部移植心脏的存活时间，减轻急性排斥反应的程度。
　　 第四部分受者同系骨髓间充质干细胞对大鼠心脏移植慢性排斥反应的影响
　　 目的：观察受者同系骨髓MSC对大鼠心脏移植慢性排斥反应的影响。
　　 方法：实验共设4组，每组5只受体大鼠，行颈部心脏移植手术：(1)同系移植组(A4组)：Wistar→Wistar，CsA2mg/kg·d腹腔注射14天；(2)慢性排斥组(B4组)：Lewis→Wistar，CsA2mg/kg·d腹腔注射14天；(3)MSC处理组(C4组)：Lewis→Wistar，CsA2mg/kg·d腹腔注射14天，术后第15天、第30天分别经尾静脉注射MSC2×106；(4)单纯CsA组(D4组)：Lewis→Wistar，CsA2mg/kg·d腹腔注射至观察终点。观察终点为术后120天。届时，取移植心做病理检查，MASSON染色，分析心脏动脉管壁增厚情况及心肌间质胶原增生情况。
　　 结果：所有受体及移植物均良好存活至观察终点。移植心脏内动脉管壁增厚比例(％)：A4组19.68±2.06，B4组29.14±1.98，C4组29.88±2.28，D4组39.82±1.84。B4-C4组之间差异无统计学意义(P>0.05)。胶原增生比例(％)：A4组8.76±1.56；B4组17.98±2.40，C4组19.50±2.24，D4组17.64±2.47。A4组纤维增生较其它各组明显减轻，差异有统计学意义(P<0.01)；B4、C4、D4各组之间差异无统计学意义(P>0.05)。
　　 结论：早期应用CsA2周后，静脉输注受者同系MSC未能减轻移植心脏慢性排斥反应的程度。